导读:本文包含了商陆抗病毒蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:商陆,抗病毒,美洲,蛋白,小鼠,非洲,转基因。
商陆抗病毒蛋白论文文献综述
黄超,张丽丽,邓柳红,张春发[1]（2016）在《海南五指山美洲商陆抗病毒蛋白PAP-Ⅰ基因的原核表达及活性验证》一文中研究指出提取春季海南五指山美洲商陆叶片总RNA,利用RT-PCR技术获得c DNA,再根据Genbank上公布的PAP-Ⅰ基因序列设计引物扩增PAP-Ⅰ基因,并连接到p~(ET)-30a载体上进行表达,表达的产物以不溶的包涵体形式存在,经过变性、镍柱亲和层析纯化,纯化后的重组蛋白经过Western Blot验证表明该基因得到了正确表达,利用柱上循环复性后的重组PAP-Ⅰ蛋白经麦胚提取物转录/翻译偶联系统验证具有抑制蛋白质合成的活性。(本文来源于《热带生物学报》期刊2016年01期）
黄超[2]（2015）在《海南五指山美洲商陆抗病毒蛋白PAP-I基因的克隆、表达及活性鉴定》一文中研究指出美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antiviral Proteins,PAPs)属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Proteins,RIP),具有 RNAN-糖苷酶的活性,能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特异位点A4324上切下一腺嘌呤,使其难与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合,从而阻碍了细胞中蛋白质的合成。PAPs是一类天然的广谱抗病毒蛋白,能够抗多种植物和动物病毒,近年来受到广大研究者的高度关注,对其分子结构、蛋白质化学和抗病毒机制等领域进行了深入广泛的研究,为抗病毒药物的研制提供理论和原料药支撑。目前,PAPs用于抗人乙肝病毒等感染的研究已取得了长足的进展,并已展现出其在医药领域应用的广阔前景。美洲商陆抗病毒蛋白在防治植物和动物病毒感染上具有显着的效果,但前提是需要获得大量的高纯度、高活性的PAP抗病毒蛋白,由于PAPs蛋白是由不同基因在不同组织和发育阶段表达的蛋白产物,无法满足大量生产的需要,若能将此类基因克隆、构建表达载体、在大肠杆菌中表达并建立高效的变性、复性关键工艺,创新建立高灵敏度、高特异性的快速抗病毒生物活性鉴定方法,表达、筛选出高纯度、高生物活性的重组抗病毒蛋白PAP,就能摆脱时间和空间的限制,较好的满足研究与产业化需求。本文选定海南五指山美洲商陆作为基因克隆和蛋白纯化的试验材料:1、取新鲜的春季叶片,提取总RNA,采用RT-PCR技术获得五指山美洲商陆的cDNA序列,以得到的cDNA序列为模板,设计带有酶切位点的引物克隆PAP-Ⅰ基因,经测序验证无碱基突变和移码突变。2、对P4P-Ⅰ基因进行生物信息学分析,结果表明PAP-Ⅰ基因的cDNA编码区全长由942个碱基组成,信号肽位于N末端,由22个氨基酸组成,C末端的29个氨基酸作为稳定区;该基因具有PAP家族典型的保守结构域,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白RIP;PAP-Ⅰ基因的亚细胞定位预测结果是定位于胞外(Extracellular);根据PAP-Ⅰ蛋白的理化性质推测PAP-Ⅰ蛋白的分子式为C1577H2493N4150469S14,其相对分子量为35.22 kD,等电点(pi)为8.86。理论推导其半衰期大约为30 h,不稳定参数为34.39,蛋白质性质稳定(标准:40以下为稳定蛋白)。亲水性平均数:-0.189,预测该蛋白为亲水性蛋白,其脂肪指数为90.29;PAP-Ⅰ蛋白的二级结构以无规卷曲为主,其次为延伸链结构和α-螺旋,β-转角所占比例最少;通过SWISS-MODEL软件对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行蛋白质叁维结构的同源建模,获得其氨基酸序列的预测叁维结构;对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行分析,结果表明PAP-Ⅰ蛋白有一个跨膜结构域;亲水和疏水性分析推测PAP-Ⅰ蛋白属于亲水性蛋白;对PAP-Ⅰ蛋白潜在磷酸化位点的分析表明,PAP-Ⅰ蛋白能够被丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶所磷酸化,从而实现其功能的调控。3、针对五指山美洲商陆PAP-/基因,构建了原核表达载体pET30a-PAP-Ⅰ。4、研究了 pET30a-PAP-Ⅰ在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化方法,通过实验获得了优化的诱导条件,0.6 mmol/L IPTG为最适的诱导浓度,最佳诱导时间为4 h。5、利用麦胚提取物转录/翻译偶联系统,根据美洲商陆抗病毒蛋白抗病毒机制及其具有抑制蛋白质合成的特性,建立了通过抑制荧光素酶合成的机理来鉴定重组蛋白生物活性的新技术。本方法与传统生物学抗病毒活性鉴定方法相比较,不但灵敏度和特异度高,而且快速、简便。6、以纯化的天然PAP蛋白作为抗原,采用交替使用完全佐剂和不完全佐剂的方法免疫新西兰长耳兔,最终获得高效价的多克隆抗体,克服了 PAP-Ⅰ蛋白免疫原性低的困难,为PAP表达纯化中进行蛋白鉴定提供了高效特异抗体。7、用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明纯化的目的蛋白为单一条带,纯化效果良好,经SDS-PAGE和Western验证,结果表明得到的蛋白为PAP-Ⅰ蛋白。8、对表达的蛋白采用柱上循环复性的方法进行复性,通过麦胚提取物转录/翻译偶联系统来鉴定重组蛋白的活性,0.2 μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率为84.1%;1.2μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率可以达到99.9%,显现出较强的抑制蛋白质合成的活性。综上所述,本研究建立了 PAP-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化技术,高效重组PAP的变性、复性关键技术和重组PAP的蛋白定量检测和生物活性检测技术,为抗病毒药物的研制和产业化提供了技术和原料的支撑。(本文来源于《海南大学》期刊2015-11-01）
向莉,李书剑,张杰文[3]（2011）在《美洲商陆抗病毒蛋白对人神经胶质瘤细胞U251细胞增殖和凋亡的影响》一文中研究指出目的:观察美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)对人神经胶质瘤细胞U251细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用MTT法检测0、20、40、60、80和100mg/LPAP处理48h以及40mg/LPAP处理24、36、48和72h对神经胶质瘤细胞U251细胞生长的影响;40mg/LPAP处理U251细胞36h后,采用荧光染色技术检测细胞凋亡,采用流式细胞仪检测U251细胞周期分布的影响;采用Northernblot和Westernblot检测40mg/LPAP处理24、48、72和96h对U251细胞周期调控蛋白FasL和Fas的影响。结果:0、20、40、60、80和100mg/LPAP处理48h,U251细胞的增殖抑制率间的差异有统计学意义(F=284.560,P=0.007),40mg/LPAP处理24、36、48和72h,U251细胞的增殖抑制率间的差异有统计学意义(F=280.250,P=0.045)。PAP促进U251细胞凋亡(t=106.350,P=0.007),PAP改变细胞周期分布,使G0+G1期细胞比例增高,S期比例降低。PAP还可上调FasL蛋白表达,下调Fas蛋白表达。结论:PAP可改变细胞周期分布,影响细胞周期调控蛋白表达,并可诱导U251细胞凋亡,从而抑制细胞增殖。(本文来源于《郑州大学学报(医学版)》期刊2011年05期）
陈西柳,贺永文[4]（2011）在《全长商陆种子抗病毒蛋白及其与HBV核心蛋白融合原核表达蛋白抑制HBV复制的机制研究》一文中研究指出目的:商陆种子抗病毒蛋白(PAP-S)是由美洲商陆的种子中分离出的一种广谱抗病毒蛋白,对多种动植物病毒,包括RNA、单链DNA和双链DNA病毒均有抑制作用。目前临床应用的抗HBV药物存在副作用较多、长期应用可产生耐药突变等缺陷,且均不能抑制位于核内的HBV cccDNA。因此,寻找新型抗病毒药物依然是慢乙肝临床研究的重要部分。HBV核心蛋白(HBc)的C端含有核定位信号,可引导其进入核内。本文旨在探讨全长PAP蛋白及PAP-HBc融合蛋白在HBV转基因小鼠模型体内抗HBV的效果。方法:以PGEM-PAP质粒为模板设计引物,PCR扩增得到全长PAP基因,经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长PAP质粒及HBc质粒为模板设计引物,PCR扩增PAP-HBc融合基因,与PMD-18T载体连接并转化,经酶切鉴定及DNA序列检测均证实为目标序列。将原核载体pET-28a与构建好的克隆用BamH和HindⅢ双酶切,连接酶切产物,经测序证实得到pET-28a-PAP-HBc原核质粒。将全长PAP、全长PAP-HBc融合质粒转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后经镍离子亲和层析柱分离纯化,得到目的蛋白。给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP组(0.125mg/kg)及PAP-HBc融合蛋白组(0.125mg/kg)。持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平;取小鼠肝、肾组织,行HE染色观察给药后肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCRN肝组织中HBV复制中间体mRNA水平。结果:构建的全长PAP基因的原核表达质粒、PAP-HBc融合基因原核表达质粒经双酶切及测序,证实各基因正确地插入到载体中,且读码框正确。诱导分离纯化得到的蛋白,经SDS-PAGE检测证实为目的蛋白。与生理盐水组相比,45天时PAP组、PAP-HBc融合蛋白组对血清HBV DNA的抑制率分别为73%(P<0.01)、77%(P<0.01);对HBsA9的抑制率分别为24.7%(P<0.01)、27.2%(P<0.01)。各组HE染色均未见肝肾组织有明显病理变化。免疫组化染色显示PAP组及PAP-HBc融合蛋白组小鼠肝脏qbHBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。PAP组、PAP-HBc融合蛋白组的HBV mRNA较生理盐水组少。结论:成功地构建了全长PAP基因及其与HBc融合的真核表达质粒,并纯化出原核表达蛋白。PAP及PAP-HBc融合蛋白在慢性HBV感染小鼠体内对HBV有抑制作用,并未见明显肝肾毒性。(本文来源于《第6届全国疑难及重症肝病大会论文集》期刊2011-09-14）
陈西柳,贺永文[5]（2011）在《天然商陆种子抗病毒蛋白抑制HBV复制的机制研究》一文中研究指出目的:商陆种子抗病毒蛋白(PAP-S)是由美洲商陆的种子中分离出的一种核糖体失活蛋白,对多种动、植物病毒都表现出很强的抗病毒活性,且对RNA、单链DNA和双链DNA病毒均有抑制作用。它在低浓度就能有效地抑制多种病毒的复制,并且不影响宿主细胞的蛋白质合成。目前临床应用的抗HBV药物存在副作用较多、长期应用可产生耐药突变等缺陷,且均不能抑制HBV cccDNA。因此,寻找新型抗病毒药物依然是慢乙肝临床研究的重要部分。本文旨在探讨天然PAP-S在HBV转基因小鼠模型体内抗HBV的效果。方法:给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和Hl3sAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP-S0.125mg/kg及0.25mg/kg组。持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平;取肝、肾组织,行HE染色观察给药后小鼠肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA含量。结果:与生理盐水组相比,45天时拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg、0.25mg/kg组对血清HBV DNA的抑制率分别为75.7%(P<0.01)、68.9%(P<0.01)、78.7%(P<0.01):对HBsA9的抑制率分别为29.7%(P<0.01)、23.3%(P<0.01)、36%(P<0.01)。各组肝肾组织HE染色均未见明显病理变化。免疫组化染色显示PAP-S组小鼠肝脏组织中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。RT-PCR结果显示天然PAP-S组HBV mRNA水平被抑制。结论:0.125及0.25mg/kg天然PAP-S在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中对HBV DNA、HBsAg、HBV mRNA有抑制作用。(本文来源于《第6届全国疑难及重症肝病大会论文集》期刊2011-09-14）
向莉,胡亚梅,张杰文[6]（2011）在《美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究》一文中研究指出目的研究美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)基因的克隆表达,进而研究其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡。方法利用RT-PCR技术克隆PAP基因,构建PAP毕赤酵母表达质粒pPICZaA-PAP并导入毕赤酵母Pichia pastorisGS115。SDS-PAGE检测PAP的分泌表达。采用镍离子亲合层析纯化PAP,并通过单细胞凝胶电泳和MTT检测其抑制人神经胶质瘤细胞U251的生长。结果分泌表达的PAP融合蛋白分子量约为35/kD,纯化的PAP在体外能诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡,PAP对U251半数抑制浓度(IC50)为81.0μg/mL,通过单细胞凝胶电泳,能看到明显的慧星尾,表明PAP引起了神经胶质瘤细胞基因组的降解。结论 PAP蛋白能抑制神经胶质瘤细胞的生长及诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡。(本文来源于《中国中西医结合杂志》期刊2011年08期）
陈西柳[7]（2011）在《商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究》一文中研究指出第一部分天然PAP-S的制备及其毒性研究目的：从美洲商陆种子中提取天然PAP-S,研究其对小鼠的急性及亚急性毒性。方法：采集美洲商陆种子,粉碎后加蒸馏水搅拌离心。上清液通过酸碱柱CM-Sephadex C-50分离酸性及碱性蛋白,碱性蛋白通过分子筛Sehpadex G-50柱收集第一洗脱峰,浓缩后通过酸碱柱CM-Sephadex C-52再次分离酸碱性蛋白,收集第二洗脱峰。SDS-PAGE检测分子量,BCA法测定蛋白质浓度。将80只昆明小鼠随机分为8组,单次腹腔注射PAP-S,每组浓度分别为0.5、0.7、1、1.4、2、2.8、4、5.6mg/kg,观察注射后14天内小鼠的健康状况及死亡率。40只昆明小鼠随机分为4组,连续14天腹腔注射PAP-S,浓度分别为0、0.125、0.25、0.5mg/kg,停药一天后采血检测血清ALT、BUN水平,取肝、肾组织做HE染色。结果：洗脱后得到分子量约为30KD的单一条带,冻干后得到约200mg粉末。取1mg粉末溶于1ml生理盐水,BCA测得蛋白浓度为0.6mg/ml。小鼠的急性毒性实验显示3天和14天时LD50分别为2.41和1.75mg/kg。亚急性毒性试验显示,高浓度PAP-S组血清ALT水平较阴性对照组轻度升高,但各组间BUN水平无显着性差异。HE染色未见明显病理变化。结论：成功制备了天然PAP-S。低浓度PAP-S无明显肝肾毒性。第二部分天然PAP-S体内抑制HBV复制的研究目的：探讨天然PAP-S在HBV转基因小鼠模型体内抗HBV的效果。方法：给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg及0.25mg/kg组。持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后白眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平；取肝、肾组织,行HE染色观察给药后小鼠肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA含量。结果：与生理盐水组相比,45天时拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg、0.25mg/kg组对血清HBV DNA的抑制率分别为75.7%(P<0.01)、68.9%(P<0.01)、78.7%(P<0.01)；对HBsAg的抑制率分别为29.7%(P<0.01)、23.3%(P<0.01)、36%(P<0.01)。各组肝肾组织HE染色均未见明显病理变化。免疫组化染色显示PAP-S组小鼠肝脏组织中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。RT-PCR结果显示天然PAP-S组HBV mRNA水平被抑制。结论：0.125及0.25mg/kg天然PAP-S在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中对HBVDNA、HBsAg、HBV mRNA有抑制作用。第叁部分全长及不同片段缺失型PAP基因及与HBV核心蛋白融合原核表达质粒的构建及蛋白纯化目的：构建全长及不同片段缺失型PAP基因原核表达质粒及与HBV核心蛋白融合的PAP原核表达质粒,并进行蛋白纯化。方法：以PGEM-PAP质粒为模板设计引物,PCR扩增得到全长及不同片段缺失型PAP基因,经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长及不同片段缺失型PAP质粒及HBc质粒为模板设计引物,PCR扩增PAP-HBc融合基因,与PMD-18T载体连接并转化,经酶切鉴定及DNA序列检测均证实为目标序列。将原核载体pET-28a与构建好的克隆用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接酶切产物,经测序证实得到pET-28a-PAP-HBc原核质粒。将全长PAP、全长PAP-HBc融合质粒转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylthio-B-D-Galactoside,IPTG)诱导后经镍离子亲和层析柱分离纯化,得到目的蛋白。结果：构建的全长及不同片段缺失型PAP基因的原核表达质粒、PAP-HBc融合基因原核表达质粒经双酶切及测序,证实各基因正确地插入到载体中,且读码框正确。诱导分离纯化得到的蛋白,经SDS-PAGE检测证实为目的蛋白。结论：成功地构建了全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒。并纯化出部分已构建质粒的蛋白。第四部分全长及HBc融合PAP基因原核表达蛋白体内抗HBV的研究目的：观察PAP12及PAP12-HBc融合蛋白在慢性乙肝病毒感染的小鼠体内对HBV的抑制作用。方法：给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP12组(0.125mg/kg)及PAP12-HBc融合蛋白组(0.125mg/kg).持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平；取小鼠肝、肾组织,行HE染色观察给药后肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA水平。结果：与生理盐水组相比,45天时PAP12组、PAP12-HBc融合蛋白组对血清HBVDNA的抑制率分别为73%(P<0.01)、77%(P<0.01)；对HBsAg的抑制率分别为24.7%(P<0.01)、27.2%(P<0.01)。各组HE染色均未见肝肾组织有明显病理变化。免疫组化染色显示PAP12组及PAP12-HBc融合蛋白组小鼠肝脏中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。PAP12组、PAP12-HBc融合蛋白组的HBV mRNA较生理盐水组少。结论：PAP12及PAP12-HBc融合蛋白在慢性HBV感染小鼠体内对HBV有抑制作用,并未见明显肝肾毒性。(本文来源于《华中科技大学》期刊2011-05-01）
周倩,高必达,王锡锋[8]（2010）在《商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探》一文中研究指出目的:筛选体外高表达商陆抗病毒蛋白的毕赤酵母重组菌株,并摸索其适合的发酵条件。方法:通过电击转化将含有商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins,PAP)基因的分泌型表达载体PIC9K-P导入到毕赤酵母(Pachia pastoris)GS115菌株中。利用免疫印迹法筛选表达量较高的转化子。在摇瓶发酵水平对重组菌株产PAP条件进行初步研究。结果:高表达PAP的重组菌株在发酵时间为96h,10g/L的甲醇浓度,培养基pH值为6.0～6.4时PAP的表达量较高。结论:免疫印迹法适合用于毕赤酵母高表达重组菌株的筛选,重组毕赤酵母的PAP表达量可高达30mg/L。(本文来源于《生物技术》期刊2010年04期）
江一北,李政,林晓露,陈凌,李凌[9]（2010）在《农杆菌介导的美洲商陆抗病毒蛋白基因对非洲菊遗传转化研究》一文中研究指出以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为材料,通过农杆菌介导法,建立高效稳定的遗传转化体系.结果表明,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间8 min,36 h的共培养,延迟筛选2 d有利于获得较高的转化效率.通过农杆菌介导,持续筛选和PCR检测,美洲商陆蛋白(PAP)基因成功转入非洲菊幼苗.(本文来源于《西南师范大学学报(自然科学版)》期刊2010年03期）
江一北[10]（2010）在《美洲商陆抗病毒蛋白基因转化非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）的研究》一文中研究指出美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein, PAP)是一种广谱抗性蛋白,可以对抗多种植物病毒,如黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、烟草坏死病毒(Tobacco necrosis virus, TNV)、苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,ALMV)、南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus, SBMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、花椰菜花叶病毒(Cauli flower mosaic virus,CaMV)、非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)等。利用农杆菌介导法将其转入到植物体内可以使植物获得广谱抗性,从而提高植株产量与质量。非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)是当今世界各地广泛栽培的着名切花。特别近几年来,由于我国鲜切花用量剧增,其种植面积急剧扩大,并且由于非洲菊本身易感病毒病,非洲菊生产时的病害问题越来越严重。当其受到病毒侵害时容易使叶片褪绿、畸形,严重时导致死亡。传统防治方法为喷洒农药,但是由于该法容易导致非洲菊上病毒耐药、抗药性的产生或农药喷洒不当而严重危害非洲菊的产量与质量,而且农药的使用还会造成环境的污染等问题。因此利用转基因技术获取抗病毒植株对于今后培育出抗病非洲菊新品种具有现实意义。本研究通过建立高效的非洲菊再生以及遗传转化体系,利用农杆菌介导法成功地将美洲商陆抗病毒蛋白基因转入到非洲菊中,通过攻毒实验以及酶活性测定显示出一定抗性,主要研究结果如下：1.非洲菊再生体系的建立通过选取无菌苗叶片和叶柄基部为外植体,以不同激素浓度配比诱导愈伤组织、不定芽、以及根的发生,建立起非洲菊的再生体系。结果显示：以叶柄基部为适合外植体,MS+BA 9.0mg/L+NAA0.1mg／L为最佳诱导愈伤培养基,MS+BA 0.8mg/L+NAA O.lmg/L为最佳诱导不定芽培养基,1／2MS+NAA 0.5 mg/L为最佳生根培养基。2.非洲菊转化体系的建立以非洲菊叶柄基部为材料,通过农杆菌介导法,建立高效稳定的遗传转化体系。结果表明,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间8 min,36 h的共培养,延迟筛选2 d有利于获得较高的转化效率。共培养培养基：MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+100umol/L乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)。延迟培养基MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+头孢霉素(Cefotaxime,Cef) 500 mg/L。芽筛选培养基：MS+BA 0.8g／L+NAA 0.1mg／L+潮霉素(Hygromicin,Hyg) 13 mg/L+Cef 500mg/L。根筛选培养基：1/2MS+NAA 0.5 mg/L+Hyg 8mg/L+Cef 500mg/L。3.转基因植株的获得以及检测通过农杆菌介导,潮霉素持续筛选和PCR检测,在14株经过潮霉素持续筛选的植株中有10株得到目的条带,美洲商陆蛋白(PAP)基因成功转入非洲菊幼苗。通过接种病毒后对植株形态的定期观测有4株植株明显表达出对病毒的抗性,生长正常。通过超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)的测定和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性测定显示转基因植株的SOD活性与CAT均高于非转基因植株,综上所述,美洲商陆抗病毒蛋白基因已成功转入非洲菊中,且表达出一定的抗病毒性。(本文来源于《西南大学》期刊2010-04-20）
商陆抗病毒蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antiviral Proteins,PAPs)属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Proteins,RIP),具有 RNAN-糖苷酶的活性,能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特异位点A4324上切下一腺嘌呤,使其难与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合,从而阻碍了细胞中蛋白质的合成。PAPs是一类天然的广谱抗病毒蛋白,能够抗多种植物和动物病毒,近年来受到广大研究者的高度关注,对其分子结构、蛋白质化学和抗病毒机制等领域进行了深入广泛的研究,为抗病毒药物的研制提供理论和原料药支撑。目前,PAPs用于抗人乙肝病毒等感染的研究已取得了长足的进展,并已展现出其在医药领域应用的广阔前景。美洲商陆抗病毒蛋白在防治植物和动物病毒感染上具有显着的效果,但前提是需要获得大量的高纯度、高活性的PAP抗病毒蛋白,由于PAPs蛋白是由不同基因在不同组织和发育阶段表达的蛋白产物,无法满足大量生产的需要,若能将此类基因克隆、构建表达载体、在大肠杆菌中表达并建立高效的变性、复性关键工艺,创新建立高灵敏度、高特异性的快速抗病毒生物活性鉴定方法,表达、筛选出高纯度、高生物活性的重组抗病毒蛋白PAP,就能摆脱时间和空间的限制,较好的满足研究与产业化需求。本文选定海南五指山美洲商陆作为基因克隆和蛋白纯化的试验材料:1、取新鲜的春季叶片,提取总RNA,采用RT-PCR技术获得五指山美洲商陆的cDNA序列,以得到的cDNA序列为模板,设计带有酶切位点的引物克隆PAP-Ⅰ基因,经测序验证无碱基突变和移码突变。2、对P4P-Ⅰ基因进行生物信息学分析,结果表明PAP-Ⅰ基因的cDNA编码区全长由942个碱基组成,信号肽位于N末端,由22个氨基酸组成,C末端的29个氨基酸作为稳定区;该基因具有PAP家族典型的保守结构域,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白RIP;PAP-Ⅰ基因的亚细胞定位预测结果是定位于胞外(Extracellular);根据PAP-Ⅰ蛋白的理化性质推测PAP-Ⅰ蛋白的分子式为C1577H2493N4150469S14,其相对分子量为35.22 kD,等电点(pi)为8.86。理论推导其半衰期大约为30 h,不稳定参数为34.39,蛋白质性质稳定(标准:40以下为稳定蛋白)。亲水性平均数:-0.189,预测该蛋白为亲水性蛋白,其脂肪指数为90.29;PAP-Ⅰ蛋白的二级结构以无规卷曲为主,其次为延伸链结构和α-螺旋,β-转角所占比例最少;通过SWISS-MODEL软件对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行蛋白质叁维结构的同源建模,获得其氨基酸序列的预测叁维结构;对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行分析,结果表明PAP-Ⅰ蛋白有一个跨膜结构域;亲水和疏水性分析推测PAP-Ⅰ蛋白属于亲水性蛋白;对PAP-Ⅰ蛋白潜在磷酸化位点的分析表明,PAP-Ⅰ蛋白能够被丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶所磷酸化,从而实现其功能的调控。3、针对五指山美洲商陆PAP-/基因,构建了原核表达载体pET30a-PAP-Ⅰ。4、研究了 pET30a-PAP-Ⅰ在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化方法,通过实验获得了优化的诱导条件,0.6 mmol/L IPTG为最适的诱导浓度,最佳诱导时间为4 h。5、利用麦胚提取物转录/翻译偶联系统,根据美洲商陆抗病毒蛋白抗病毒机制及其具有抑制蛋白质合成的特性,建立了通过抑制荧光素酶合成的机理来鉴定重组蛋白生物活性的新技术。本方法与传统生物学抗病毒活性鉴定方法相比较,不但灵敏度和特异度高,而且快速、简便。6、以纯化的天然PAP蛋白作为抗原,采用交替使用完全佐剂和不完全佐剂的方法免疫新西兰长耳兔,最终获得高效价的多克隆抗体,克服了 PAP-Ⅰ蛋白免疫原性低的困难,为PAP表达纯化中进行蛋白鉴定提供了高效特异抗体。7、用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明纯化的目的蛋白为单一条带,纯化效果良好,经SDS-PAGE和Western验证,结果表明得到的蛋白为PAP-Ⅰ蛋白。8、对表达的蛋白采用柱上循环复性的方法进行复性,通过麦胚提取物转录/翻译偶联系统来鉴定重组蛋白的活性,0.2 μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率为84.1%;1.2μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率可以达到99.9%,显现出较强的抑制蛋白质合成的活性。综上所述,本研究建立了 PAP-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化技术,高效重组PAP的变性、复性关键技术和重组PAP的蛋白定量检测和生物活性检测技术,为抗病毒药物的研制和产业化提供了技术和原料的支撑。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
商陆抗病毒蛋白论文参考文献
[1].黄超,张丽丽,邓柳红,张春发.海南五指山美洲商陆抗病毒蛋白PAP-Ⅰ基因的原核表达及活性验证[J].热带生物学报.2016
[2].黄超.海南五指山美洲商陆抗病毒蛋白PAP-I基因的克隆、表达及活性鉴定[D].海南大学.2015
[3].向莉,李书剑,张杰文.美洲商陆抗病毒蛋白对人神经胶质瘤细胞U251细胞增殖和凋亡的影响[J].郑州大学学报(医学版).2011
[4].陈西柳,贺永文.全长商陆种子抗病毒蛋白及其与HBV核心蛋白融合原核表达蛋白抑制HBV复制的机制研究[C].第6届全国疑难及重症肝病大会论文集.2011
[5].陈西柳,贺永文.天然商陆种子抗病毒蛋白抑制HBV复制的机制研究[C].第6届全国疑难及重症肝病大会论文集.2011
[6].向莉,胡亚梅,张杰文.美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究[J].中国中西医结合杂志.2011
[7].陈西柳.商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究[D].华中科技大学.2011
[8].周倩,高必达,王锡锋.商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探[J].生物技术.2010
[9].江一北,李政,林晓露,陈凌,李凌.农杆菌介导的美洲商陆抗病毒蛋白基因对非洲菊遗传转化研究[J].西南师范大学学报(自然科学版).2010
[10].江一北.美洲商陆抗病毒蛋白基因转化非洲菊（GerberajamesoniiBolus）的研究[D].西南大学.2010
论文知识图
