影响草酸青霉纤维素酶合成的膜蛋白鉴定及其功能研究

论文摘要

草酸青霉（Penicillium oxalicum）分泌的纤维素酶组分比里氏木霉（Trichoderma reesei）的更丰富、合理,β-葡萄糖苷酶酶活力更高,已成为生物炼制的研究热点。草酸青霉菌株HP7-1是本实验从原始森林筛选出的一株能高效降解木质纤维素的丝状真菌。对P.oxalicum HP7-1基因组和转录组测定已完成,其纤维素酶表达调控的机理也得到了一定的揭示。纤维素酶的产生涉及到纤维素的诱导、基因表达调控、纤维素酶的合成、转运和分泌等诸多方面。转运蛋白在运送可溶性糖进入细胞及形成纤维素诱导信号过程中起到关键作用。对于木质纤维素降解真菌而言,糖分子本身既是碳源,又是重要的信号分子,与木质纤维素降解酶的诱导表达息息相关。因此,与纤维素酶合成相关的膜蛋白特别是糖转运蛋白的研究对进一步认识纤维素的降解利用具有重要意义。本课题首先构建了草酸青霉可重复利用筛选标记PyrG转化系统,解决转化系统筛选标记不足的问题,利于对草酸青霉进行基因敲除和遗传改造。首先,以PyrG缺失菌株△ku70△PyrG-K（以kan为筛选标记敲除了PyrG 基因）为宿主菌,构建kan删除盒（5kan-T-PyrG-T-3kan）,筛选标记PyrG两侧加入相同的一段终止子序列TT便于后继自我剪切。然后,将kan删除盒转化△ku70△PyrG-K,依次用m-met基本培养基、添加5’-氟乳清酸（5’-FOA）和尿嘧啶的PDA培养基分别筛选PyrG标记及其自我剪切,最后获得PopyrG基因敲除且无筛选标记kan的突变株△ku70△PyrG。成功构建以△Ku70△PyrG为出发菌株,PyrG为筛选标记的可重复利用遗传转化系统。通过分析P.oxalicum纤维素酶高产菌或条件（HP）与低产菌或条件（LP）的差异转录组,挑选出转录水平有显著差异（Fold Change>2.0,P-value与FDR值均≤0.05）的3个膜蛋白基因:纤维寡糖转运蛋白编码基因CDT-C（POX06051）、葡萄糖/半乳糖转运蛋白编码基因（POX06641）、细胞壁疏水蛋白编码基因Rod△（POX011764）和1个假定氨基脱氧分支酸合成酶（Salicylate synthase）编码基因（POX07269）为候选基因。首先,分别构建4个候选基因敲除突变株△POX06051、△POX01764、△POX06641、△AOX07269。测定在麦麸+Avicel诱导培养条件下△POX06051、△POX011764、△POX06641、△POX07269和△ku70分泌蛋白的量,发现敲除了POX06051、POX01764、POX06641、POX07269与△ku70相比没有明显的差异。在麦麸 Aicel 培养条件下,△POX06051、△POX01764、△FOX06641、△POX07269和△ku70相比β-葡萄糖苷酶活力均上升,其中突变菌株△POX01764酶活力与△ku70相比上升了 138%。△POX069051、△POX01764、△POX06641、△POX07269木聚糖酶活力与△ku70相比均下降,其中突变菌株△POX06051木聚糖酶活力下降了 74.5%。在淀粉培养条件下,突变菌株△POX06051生木薯淀粉酶活力和可溶性淀粉酶活力与△ku70相比分别下降了59.7%和64.5%。说明膜蛋白参与了纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶分泌的过程。本课题为改造膜蛋白提高草酸青霉菌分泌蛋白产量提供了理论指导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 丝状真菌表达系统
•     1.1.1 丝状真菌遗传转化系统
•     1.1.2 丝状真菌筛选标记
•   1.2 丝状真菌蛋白分泌途径
•     1.2.1 真菌蛋白分泌系统
•     1.2.2 提高生物质降解酶分泌表达的策略
•   1.3 膜蛋白在丝状真菌生物质降解酶合成调控中的作用
•     1.3.1 MFS超家族蛋白在丝状真菌生物质降解酶合成调控中的作用
•     1.3.2 纤维寡糖转运蛋白在丝状真菌生物质降解酶合成调控中的作用
•   1.4 课题的目的和意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌种和质粒
•     2.1.2 酶和化学试剂及主要仪器
•     2.1.3 所用培养基与微量试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 候选基因敲除盒构建
•     2.2.2 丝状真菌原生质体制备
•     2.2.3 原生质体转化实验
•     2.2.4 pyrG缺失菌株原生质体转化实验
•     2.2.5 转化菌株的单孢分离
•     2.2.6 真菌总DNA提取
•     2.2.7 真菌总蛋白提取
•     2.2.8 纤维素酶活测定
•     2.2.9 淀粉酶活测定
•     2.2.10 草酸青霉菌株的培养
•     2.2.11 真菌总RNA的提取
•     2.2.12 定量RT-PCR
• 第三章 结果与分析
•   3.1 草酸青霉可重复利用筛选标记的转化系统构建
•     3.1.1 反向筛选标记的构建
•     3.1.2 利用反向筛选标记pyrG删除草酸青霉菌株中kan基因
•     3.1.3 突变菌株△ku70△kan和△ku70△R-PyrG的表型特征
•     3.1.4 小结
•   3.2 草酸青霉纤维素酶合成相关的膜蛋白鉴定及其功能研究
•     3.2.1 与纤维素酶合成相关的膜蛋白筛选、鉴定
•     3.2.2 与纤维素酶合成相关的膜蛋白的系统进化分析
•     3.2.3 候选基因缺失突变株的构建
•     3.2.4 候选基因缺失突变菌株表型
•     3.2.5 候选基因敲除对突变株蛋白分泌的影响
•     3.2.6 候选基因敲除对胞外纤维素酶的影响
•     3.2.7 候选基因敲除对胞外淀粉酶活力的影响
•     3.2.8 敲除POX06051基因对纤维素酶基因转录水平的影响
•     3.2.9 小结
• 参考文献
• 附录一
• 致谢
• 硕士研究生期间论文发表情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苏丹

导师: 秦秀林

关键词: 草酸青霉,无筛选标记系统,膜转运蛋白,纤维素酶

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q51

总页数: 84

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