难培养微生物Christensenella minuta的培养策略研究

论文摘要

Christensenellaceae（简称C.）家族细菌是存在于人类或者动物肠道的一类严格厌氧的难培养微生物。研究表明C.家族细菌是宿主代谢的重要参与者,拥有高丰度C.家族细菌的个体往往拥有更加苗条的身材,C.家族细菌表现出对肥胖病治疗的潜能。C家族细菌尚未实现高丰度培养,本文以Christensenella minuta（C.minuta）为研究材料,建立了快速、灵敏检测样本中C.minuta浓度的SYBR Green I qPCR检测方法,通过生物信息学分析,探讨了C.minuta培养的限制因素,运用响应面法优化了C.minuta培养条件,取得了以下成果:（1）利用C.minuta基因组信息,设计并验证了一对特异引物,通过构建重组质粒标准品,建立了快速检测C.minuta丰度的SYBR Green I qPCR检测方法,实现了对样本中C.minuta丰度的绝对定量。（2）通过Komodo预测了适合C.minuta生长的培养基,利用KEGG对C.minuta的代谢通路进行分析,试验结果表明改良GAM培养基为C.minuta最适培养基,依据C.minuta代谢缺陷,添加了L-丝氨酸、L-甘氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、5-尿苷一磷酸二钠盐、胞苷-5-磷酸二钠、盐酸吡哆辛、钴胺素来优化培养基的成分。（3）探究了C.minuta的培养温度、pH、NaCl浓度、共生菌种类、益生元种类等单因素条件,结果显示C.minuta的最适培养温度为35℃、最适pH为7～8、最适NaCl浓度为40 g/L、保加利亚乳杆菌对C.minuta的增菌倍数（Multiples）最多,达到3.08倍;菊粉对C.minuta的促生长作用最显著。（4）PB（Plackett-Burman）实验结果表明L-半胱氨酸、VB6、NaCl是对C.minuta增菌效果影响最大的3个因素。3个因素两两交互的分析的contour和3D图显示在模型取值范围内Multiples能取到最大值。当L-半胱氨酸=65.466 mg/L,VB6=23.997 mg/L,NaCl=42.537 g/L时,Multiplesmax=3.667。经检验,在上述条件下实际Multiples=3.601,响应面实验模型的P-value小于0.0001,说明实验成功。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 .C家族细菌简介
•     1.1.1 C家族细菌的发现
•     1.1.2 C.家族的生理生化特性
•     1.1.3 C.家族各成员基因组信息比较
•     1.1.4 C.家族的生理功能
•   1.2 未/难培养微生物的培养方法
•     1.2.1 原位培养法
•     1.2.2 传统培养基改良法
•     1.2.3 高通量培养法
•   1.3 .研究目的和意义
•   1.4 .本研究采取的技术路线
• 第二章 建立C.minuta荧光定量PCR检测方法
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 仪器
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 C.minuta特异引物设计
•     2.2.2 C.minuta引物特异性验证结果
•     2.2.3 重组质粒标准品的制备与拷贝数关系
•     2.2.4 C.minuta的荧光定量检测
•   2.3 本章小结
• 第三章 C.minuta培养基预测及代谢通路分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 数据库
•     3.1.2 试剂
•     3.1.3 仪器
•     3.1.4 方法
•   3.2 结果与讨论
•     3.2.1 C.minuta培养基预测结果
•     3.2.2 C.minuta的最适培养基的验证结果
•     3.2.3 C.minuta代谢通路缺陷分析结果
•     3.2.4 C.minuta代谢缺陷物验证结果
•   3.3 本章小结
• 第四章 C.minuta培养条件优化
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 试剂
•     4.1.3 培养基
•     4.1.4 方法
•   4.2 结果与讨论
•     4.2.1 单因素实验结果
•     4.2.2 Plackett Burman 实验结果
•     4.2.3 响应面实验结果
•   4.3 本章小结
• 第五章 总结与创新点
•   5.1 结论
•   5.2 创新点与局限性
•   5.3 今后工作计划
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 肖红仕

导师: 周海燕

关键词: 定量分析,代谢组学分析,培养条件优化

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖南农业大学

基金: 湖南农业大学农业生物工程研究所,湖南省自然科学基金,北京擎科新业有限公司,湖南千山制药机械股份有限公司,上海百趣生物有限公司

分类号: Q93-335

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000682

总页数: 58

文件大小: 2912k