一种牡蛎肽的制备方法论文和设计-姜乃义

全文摘要

本发明公开了一种牡蛎肽的制备方法，属于生物活性成分技术领域。包括以下步骤:（1）浸泡处理；（2）灭菌处理；（3）酶解；（4）灭酶；（5）离心分离；（6）采用超滤超频振动分离技术，其中过滤膜采用甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜；（7）将步骤（6）的滤液进行喷雾干燥，包装储存，得到牡蛎肽。本发明的有益效果是：牡蛎肽的制备方法中采用特殊制备方法制备了甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，配合超滤超频振动分离技术，改善了分离效率和效果，提高了牡蛎肽的ACE抑制活性和抗氧化活性。

主设计要求

1.一种牡蛎肽的制备方法，该方法包括以下步骤:（1）浸泡处理：将牡蛎去壳取肉，加入蒸馏水，置于4-6℃条件下进行浸泡，每隔10min轻轻搅拌，1h后换水，换水后2h弃去浸泡外液；（2）灭菌处理：牡蛎肉捣碎匀浆，加入酶解罐中，再加入蒸馏水，调节加热器温度并不断搅拌，当酶解罐温度升至70-80℃时保持10-15min，使牡蛎肉灭菌同时实现蛋白变性，反应结束后加入常温蒸馏水，调节温度至50℃，得到含有牡蛎肉的液体组合物；（3）酶解：当酶解罐温度为50℃时，利用氢氧化钠调整PH值至7.0-8.0，加入占液体组合物重量3-4%的复合蛋白酶进行第一步酶解，酶解时间为6-8h，酶解过程中打开搅拌装置使物料充分反应，反应结束后调节加热器温度至55℃，利用氢氧化钠调整PH值至8.0-8.5，再加入占液体组合物重量2-3%的碱性蛋白酶进行二次酶解，酶解温度为50-60℃，酶解时间为3-5h；得到酶解物料；（4）灭酶：反应结束后，对酶解物料进行85-95℃充分灭酶，灭酶后待温度降为40℃时，得到酶解液；（5）离心分离：将酶解液加入离心机进行离心分离，5000-8000r\/min，25℃，25min，得到上清液；（6）对上清液进行膜分离：膜分离采用超滤超频振动分离技术，分离上清液，收集滤液；（7）将滤液进行喷雾干燥，包装储存，得到牡蛎肽；其中,所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，其中，所述步骤（6）中的膜分离采用的过滤膜为甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，其制备方法如下（A）将石墨烯粉末加入到去离子水中，超声处理，得到石墨烯液体；（B）将N,N-二环己脲和氨基酸混合物，加入到石墨烯液体中；（C）将步骤（B）得到的液体进行油浴磁力搅拌反应，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；（D）将改性石墨烯粉末、成孔剂PVP溶于DMAC中，油浴搅拌制成液体铸膜液A，将甲壳素溶于DMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；（E）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置，取出后放入去离子水中浸泡，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜；所述超滤超频振动分离技术包括以下步骤：（a）将上清液装入超频震动过滤机，温度为50-55℃，振动频率50-60Hz，压力差为300-350psi，振动时间10-15min；（b）冷却至室温，收集滤液。

设计方案

1.一种牡蛎肽的制备方法，该方法包括以下步骤:

（1）浸泡处理：将牡蛎去壳取肉，加入蒸馏水，置于 4-6℃条件下进行浸泡，每隔10min轻轻搅拌，1h后换水，换水后2h弃去浸泡外液；

（2）灭菌处理：牡蛎肉捣碎匀浆，加入酶解罐中，再加入蒸馏水，调节加热器温度并不断搅拌，当酶解罐温度升至 70-80℃时保持10-15min，使牡蛎肉灭菌同时实现蛋白变性，反应结束后加入常温蒸馏水，调节温度至 50℃，得到含有牡蛎肉的液体组合物；

（3）酶解：当酶解罐温度为50℃时，利用氢氧化钠调整PH值至7.0-8.0，加入占液体组合物重量3-4%的复合蛋白酶进行第一步酶解，酶解时间为6-8h，酶解过程中打开搅拌装置使物料充分反应，反应结束后调节加热器温度至55℃，利用氢氧化钠调整PH值至8.0-8.5，再加入占液体组合物重量2-3%的碱性蛋白酶进行二次酶解，酶解温度为50-60℃，酶解时间为3-5h；得到酶解物料；

（4）灭酶：反应结束后，对酶解物料进行85-95℃充分灭酶，灭酶后待温度降为40 ℃时，得到酶解液；

（5）离心分离：将酶解液加入离心机进行离心分离，5000-8000r\/min，25℃，25min，得到上清液；

（6）对上清液进行膜分离：膜分离采用超滤超频振动分离技术，分离上清液，收集滤液；

（7）将滤液进行喷雾干燥，包装储存，得到牡蛎肽；

其中,所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，

其中，所述步骤（6）中的膜分离采用的过滤膜为甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，其制备方法如下

（A）将石墨烯粉末加入到去离子水中，超声处理，得到石墨烯液体；

（B）将N,N-二环己脲和氨基酸混合物，加入到石墨烯液体中；

（C）将步骤（B）得到的液体进行油浴磁力搅拌反应，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（D）将改性石墨烯粉末、成孔剂PVP溶于DMAC中，油浴搅拌制成液体铸膜液A，将甲壳素溶于DMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（E）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置，取出后放入去离子水中浸泡，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜；

所述超滤超频振动分离技术包括以下步骤：

（a）将上清液装入超频震动过滤机，温度为50-55℃，振动频率50-60Hz，压力差为300-350psi，振动时间10-15min；

（b）冷却至室温，收集滤液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，其重量比为1:2.0-2.5。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜的制备包括以下步骤：

（1）将50-60mg石墨烯粉末加入到50-60ml去离子水中，超声处理1h；

（2）将氨基酸混合物和N,N二环己脲，加入到上述石墨烯液体中；氨基酸混合物和N,N二环己脲总重量为25-30mg；

（3）在60-65℃的条件下，将步骤（2）得到的液体油浴磁力搅拌反应10-15h，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（4）取30-35mg改性石墨烯粉末、10-15ml成孔剂PVP溶于100-120mlDMAC中，在60-65℃的条件下油浴并搅拌10-12h后，制成液体铸膜液A；将20-25mg甲壳素溶于60-65mlDMAC，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（5）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，氨基酸混合物由赖氨酸和谷氨酸组成；N,N-二环己脲、赖氨酸、谷氨酸的重量比为1:2:2。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中，喷雾干燥具体为：打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾，进口温度

为 160-180℃，雾化器为 300-360Hz，蠕动泵转速为14-20rpm；

包装储存具体为：将喷雾干燥的牡蛎肽用食品级聚乙烯 PE 塑料袋进行包装，封口以隔氧防潮，成品置于4-6℃冰箱保藏。

6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的牡蛎肽。

设计说明书

技术领域

本发明涉及一种生物活性成分技术领域，尤其涉及一种牡蛎肽的制备及应用。

背景技术

我国海域广阔，海洋面积约 300 万平方公里。作为海洋大省，福建省海域面积为13.6万平方公里，拥有丰富的海洋生物资源。然而，我国对海洋生物资源的精深加工能力仍相对不足，海洋资源的综合利用率低下，造成海洋资源产品附加值不高，严重制约我国海洋资源向高层次、高水平和高利用率方向发展。牡蛎的加工方式主要有新鲜、干制、罐头及制备蚝油，随着广大消费者对高质量海洋食品的需求提高，落后的传统加工技术已无法满足时代发展的需要。因此，如何实现牡蛎的精深加工和高值化利用，促进牡蛎的产业化已成为关注热点。

生物活性肽由于其特殊的生理功能而受到人们广泛的关注,一些新的生物活性肽逐渐被发现和确认。由食品蛋白研制的生物活性肽应用前景广阔。目前,生物活性肽的生产主要有三种方法化学合成、基因工程、酶法生产。这三种方法各有优缺点,其中以酶法生产发展较快,不仅可以试验室操作,而且可以实现工业化。目前,生物活性肽在食品加工过程中的变化应当引起注意,生物活性肽的分离方法仍需突破。

膜分离技术的实质是根据混合物的物理、化学性质的不同，使其被具有不同选择透过性的膜分离开。膜分离技术的优点：其分离效率高，且大多数可在

较温和的条件进行，操作的温度和压强较低，适合生物活性物质的分离，可最大限度地保存产品的生物活性；其分离过程能耗小，一般不涉及相变。此外，膜分离过程还有污染小、操作灵活、易实现自动化等优点。

超滤：膜孔径为1nm-0.05nm，可分离相对分子质量大于500的大分子和胶体。以压力差为推动力，含有大、小分子溶质的溶液流过超滤膜表面时，溶剂和小分子物质（如无机盐类）透过膜，作为透过液被收集起来；而大分子溶质（如有机胶体）则被膜截留作为浓缩液被回收。

纤维素及其衍生物作为分离膜材料可追溯到100 多年前，人们用铜氨法制备再生纤维素膜，近年来，各种高性能功能性纤维素及其衍生物的分离膜层出不穷，并已经成功地应用于反渗透、超滤、微滤、气体分离、渗透气化等膜过程，已在水处理、食品、制药、生物制品和气体的分离、浓缩和提纯等方面得到了广泛的应用。

膜种类在生物活性成分的提取过程中起到重要作用，由于牡蛎肉经蛋白酶作用所得到的产物中,存在一些相对分子质量较小的组分,同时产物体系含有大量的水分,因此,基于膜分离的特点和优点,通过特定膜对活性成分进行有效分离，成为该领域的研究重点。

发明内容

本发明提供了一种牡蛎肽的制备方法，特别采用了甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，并提供了复合膜的制备方法，配合超滤超频振动分离技术，改善了分离效率和效果，提高了牡蛎肽的ACE抑制活性和抗氧化活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种牡蛎肽的制备方法，该方法包括以下步骤:

（1）浸泡处理：将牡蛎去壳取肉，加入蒸馏水，置于 4-6℃条件下进行浸泡，每隔10min轻轻搅拌，1h后换水，换水后2h弃去浸泡外液；

（3）酶解：当酶解罐温度为50℃时，利用氢氧化钠调整PH值至7.0-8.0，加入占液体组合物重量3-4%的复合蛋白酶进行第一步酶解，复合蛋白酶为：木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，其重量比为1:2.0-2.5，酶解时间为6-8h，酶解过程中打开搅拌装置使物料充分反应，反应结束后调节加热器温度至55℃，利用氢氧化钠调整PH值至8.0-8.5，再加入占液体组合物重量2-3%的碱性蛋白酶进行二次酶解，酶解温度为50-60℃，酶解时间为3-5h；得到酶解物料；

（4）灭酶：反应结束后，对酶解物料进行85-95℃充分灭酶，灭酶后待温度降为40℃时，得到酶解液；

（5）离心分离：将酶解液加入离心机进行离心分离，5000-8000r\/min，25℃，25min，得到上清液；

（6）对上清液进行膜分离：膜分离采用超滤超频振动分离技术，分离上清液，收集滤液；

（7）将滤液进行喷雾干燥，包装储存，得到牡蛎肽。

其中，所述步骤（6）中，膜分离采用的过滤膜为甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，其制备方法包括以下步骤：

（1）将石墨烯粉末加入到去离子水中，超声处理，得到石墨烯液体；

（2）将N,N-二环己脲和氨基酸混合物，加入到石墨烯液体中；

（3）将步骤（2）得到的液体进行油浴磁力搅拌反应，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（4）将改性石墨烯粉末、成孔剂PVP溶于DMAC中，油浴搅拌制成液体铸膜液A，将甲壳素溶于DMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（5）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置，取出后放入去离子水中浸泡，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

所述甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜的制备包括以下步骤：

（1）将50-60mg石墨烯粉末加入到50-60ml去离子水中，超声处理1h；

（2）将氨基酸混合物和N,N二环己脲，加入到上述石墨烯液体中；氨基酸混合物和N,N二环己脲总重量为25-30mg，氨基酸混合物由赖氨酸和谷氨酸组成；N,N-二环己脲、赖氨酸、谷氨酸的重量比为1:2:2。

（3）在60-65℃的条件下，将步骤（2）得到的液体油浴磁力搅拌反应10-15h，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（4）取30-35mg改性石墨烯粉末、10-15ml成孔剂PVP溶于100-120mlDMAC中，在60-65℃的条件下油浴并搅拌10-12h后，制成液体铸膜液A；将20-25mg甲壳素溶于60-65mlDMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（5）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

甲壳素是自然界生物合成量仅次于纤维素的天然高分子，其主要来源是甲壳纲动物如虾、蟹的外壳和某些菌类、藻类的细胞壁，分子结构是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄聚糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄聚糖以β-1，4 糖苷键连接而成的二元线型聚合物。具有理想的孔隙度、亲水性、渗透率、防污能力和选择渗透性能，可应用于蛋白质分离领域。

氧化石墨稀表面大量的含氧官能团羟基、羧基和环氧等，赋予它较好的亲水性能。同时，这些官能团的存在，以及较大的比表面积，利于氧化石墨烯的进一步功能化，获得具有特殊性能的氧化石墨烯基衍生物与复合物，从而拓展氧化石墨烯ＧＯ的应用范围。氧化化石墨烯进行氨基酸改性，可能得到性能优异的复合物，对机体有一定的功能和优良的生物相容性。

改性过得氧化石墨烯与纤维膜结合能赋予纤维膜生物相容性的性能，有利于生物活性物质的提取。

上述超滤超频分离技术包括以下步骤：

（1）将上清液装入超频震动过滤机，温度为50-55℃，振动频率50-60Hz，压力差为300-350psi，振动时间10-15min；

（2）冷却至室温，收集滤液。

超滤膜上的微孔具有不对称结构。在滤膜的工作面上有一层极薄的致密层，下层是结构较疏松的支撑层，空隙大。超滤膜是一种“静态”膜分离技术为单纯依赖压力达到分离目的的错流操作方式容易造成堵塞的原因是进料液与膜之间的剪切力不足，使料液中的微粒、凝胶等积聚和吸附于膜表面，造成膜孔径的堵塞，以致通量急剧衰减，甚至会完全堵塞膜孔径终止过滤过程。

超频超滤膜滤技术可有效解决目前困扰“静态”膜分离技术的膜污染、堵塞等膜性能变化问题同时能大大增加滤过效率，并减少膜的清洗周期，延长膜的使用寿命。

上述喷雾干燥具体为：打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾，进口温度为160-180℃，雾化器为 300-360Hz，蠕动泵转速为14-20rpm；包装储存具体为：将喷雾干燥的牡蛎肽用食品级聚乙烯 PE 塑料袋进行包装，封口以隔氧防潮，成品置于4-6℃冰箱保藏。

本发明还提供了一种由上述的制备方法得到的牡蛎肽。

本发明的有益效果是：牡蛎肽的制备方法中采用特殊制备方法制备了甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，配合超滤超频振动分离技术，改善了分离效率和效果，提高了牡蛎肽的ACE抑制活性和抗氧化活性。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

本发明实施例提供了一种牡蛎肽的制备方法，该方法包括以下步骤:

（1）浸泡处理：将牡蛎去壳取肉，加入蒸馏水，置于 4℃条件下进行浸泡，每隔10min轻轻搅拌，1h后换水，换水后2h弃去浸泡外液；

（2）灭菌处理：牡蛎肉捣碎匀浆，加入酶解罐中，再加入蒸馏水，调节加热器温度并不断搅拌，当酶解罐温度升至 70℃时保持10min，使牡蛎肉灭菌同时实现蛋白变性，反应结束后加入常温蒸馏水，调节温度至 50℃，得到含有牡蛎肉的液体组合物；

（3）酶解：当酶解罐温度为50℃时，利用氢氧化钠调整PH值至7.0，加入占液体组合物重量3%的复合蛋白酶进行第一步酶解，复合蛋白酶为：木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，其重量比为1:2.0，酶解时间为6h，酶解过程中打开搅拌装置使物料充分反应，反应结束后调节加热器温度至55℃，利用氢氧化钠调整PH值至8.0，再加入占液体组合物重量2%的碱性蛋白酶进行二次酶解，酶解温度为50℃，酶解时间为3h；得到酶解物料；

（4）灭酶：反应结束后，对酶解物料进行85℃充分灭酶，灭酶后待温度降为40 ℃时，得到酶解液；

（5）离心分离：将酶解液加入离心机进行离心分离，5000r\/min，25℃，25min，得到上清液；

（6）对上清液进行膜分离：膜分离采用超滤超频振动分离技术，分离上清液，收集滤液；

其中，上述步骤（6）中膜分离采用的过滤膜为甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，其制备方法包括以下步骤：

（1）将50mg石墨烯粉末加入到50ml去离子水中，超声处理1h；

（2）将氨基酸混合物和N,N二环己脲，加入到上述石墨烯液体中；氨基酸混合物和N,N二环己脲总重量为25mg，氨基酸混合物由赖氨酸和谷氨酸组成；N,N-二环己脲、赖氨酸、谷氨酸的重量比为1:2:2。

（3）在60℃的条件下，将步骤（2）得到的液体油浴磁力搅拌反应10h，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（4）取30mg改性石墨烯粉末、10ml成孔剂PVP溶于100mlDMAC中，在60℃的条件下油浴并搅拌10h后，制成液体铸膜液A；将20mg甲壳素溶于60mlDMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（5）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

上述超滤超频分离技术包括以下步骤：

（1）将上清液装入超频震动过滤机，温度为50℃，振动频率50Hz，压力差为300psi，振动时间10min；

（2）冷却至室温，收集滤液。

实施例2

本发明提供了一种牡蛎肽的制备方法，该方法包括以下步骤:

（1）浸泡处理：将牡蛎去壳取肉，加入蒸馏水，置于 6℃条件下进行浸泡，每隔10min轻轻搅拌，1h后换水，换水后2h弃去浸泡外液；

（2）灭菌处理：牡蛎肉捣碎匀浆，加入酶解罐中，再加入蒸馏水，调节加热器温度并不断搅拌，当酶解罐温度升至 80℃时保持15min，使牡蛎肉灭菌同时实现蛋白变性，反应结束后加入常温蒸馏水，调节温度至 50℃，得到含有牡蛎肉的液体组合物；

（3）酶解：当酶解罐温度为50℃时，利用氢氧化钠调整PH值至8.0，加入占液体组合物重量4%的复合蛋白酶进行第一步酶解，复合蛋白酶为：木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，其重量比为1:2.5，酶解时间为8h，酶解过程中打开搅拌装置使物料充分反应，反应结束后调节加热器温度至55℃，利用氢氧化钠调整PH值至8.5，再加入占液体组合物重量3%的碱性蛋白酶进行二次酶解，酶解温度为60℃，酶解时间为5h；得到酶解物料；

（4）灭酶：反应结束后，对酶解物料进行95℃充分灭酶，灭酶后待温度降为40 ℃时，得到酶解液；

（5）离心分离：将酶解液加入离心机进行离心分离，8000r\/min，25℃，25min，得到上清液；

（6）对上清液进行膜分离：膜分离采用超滤超频振动分离技术，分离上清液，收集滤液。

其中，步骤（6）中，膜分离采用的过滤膜为甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜，其制备方法包括以下步骤：

（1）将60mg石墨烯粉末加入到60ml去离子水中，超声处理1h；

（2）将氨基酸混合物和N,N二环己脲，加入到上述石墨烯液体中；氨基酸混合物和N,N二环己脲总重量为30mg，氨基酸混合物由赖氨酸和谷氨酸组成；N,N-二环己脲、赖氨酸、谷氨酸的重量比为1:2:2。

（3）在65℃的条件下，将步骤（2）得到的液体油浴磁力搅拌反应15h，冷却到室温，离心干燥得到改性石墨烯粉末；

（4）取35mg改性石墨烯粉末、15ml成孔剂PVP溶于120mlDMAC中，在65℃的条件下油浴并搅拌12h后，制成液体铸膜液A；将25mg甲壳素溶于65mlDMAC中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

（5）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

上述超滤超频分离技术包括以下步骤：

（1）将上清液装入超频震动过滤机，温度为55℃，振动频率60Hz，压力差为350psi，振动时间15min；

（2）冷却至室温，收集滤液。

对比例1

该对比例为一种牡蛎肽的制备方法，该方法参照实施例1，但与实施例1不同之处在于，过滤膜采用是醋酸纤维膜。

对比例2

该对比例为一种牡蛎肽的制备方法，该方法参照实施例1，但与实施例1不同之处在于，过滤膜的制备步骤如下：

1）将25mg甲壳素溶于65mlDMAC中，制得铸膜液；

2）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到甲壳素\/醋酸纤维复合膜。

对比例3

该对比例为一种牡蛎肽的制备方法，该方法参照实施例1，但与实施例1不同之处在于，过滤膜的制备步骤如下：

1）将60mg石墨烯粉末加入到60ml去离子水中，超声处理1h；

2）将35mg改性石墨烯粉末，15ml成孔剂PVP溶于120mlDMAc中，油浴65℃搅拌12h制成液体铸膜液A，将25mg甲壳素溶于65ml二甲基乙酰胺中，然后加入到铸膜液A中得到铸膜液B；

3）将醋酸纤维素膜浸泡于铸膜液B中静置10s，取出后放入60℃去离子水中浸泡10min，取出后室温下干燥得到复合膜。

对比试验一

根据以上实施例1与对比例1-3进行如下试验

1、·OH 清除能力的测定

于 2.0 m L 离心管中依次加入200 µL 样品、200 µL 9 mmol\/L Fe SO _{4<\/sub>、200 µL9 mmol\/L 水杨酸乙醇溶液和 200 µL 8.8mmol\/L H _{2<\/sub>O_{2<\/sub>，然后用去离子水定容至 2.0 m L，37 ℃ 下反应 10 min，于510 nm 处测定反应液吸光值。以去离子水代替样品作对照。}}}

·OH 清除率计算方法：

·OH 清除率（%）=[(A _{对<\/sub>-A_{样<\/sub>）\/A对]×100}}

式中：A样为样品所测吸光值；

A对为对照样所测吸光值

2、DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定

在 1.5 m L 离心管中依次加入 400 µL 样品、400 µL 0.2 mmol\/L DPPH 无水乙醇溶液，充分混匀后避光反应 30 min。反应结束后，5000×rpm 离心 10 min，吸取上清在517 nm 处测定吸光度。其中，对照组用去离子水代替样品，空白组用无水乙醇代替 DPPH无水乙醇溶液。

DPPH·清除率的计算方法

DPPH·清除率（%）=[1-(A_{样<\/sub>-A_{空<\/sub>) \/A _{对<\/sub>]×100}}}

式中：A样为样品所测吸光值；

A空为空白样所测吸光值；

A对为对照样所测吸光值。

3、清除超氧阴离子自由基活性的测定

首先取0.1mol\/LpH8.0Tris-HCL缓冲液含(EDTA)于样品试管中，然后加入0.1ml的样品,混匀后于25℃水浴中保温10min,加入0.1ml0.1mmol\/L邻苯三酚，迅速混匀，在320nm下每隔30s读取吸光度，反应4.5min结束，空白管用双蒸水代替样品。

清除率的计算公式为

清除率I(%)=[(A_{0<\/sub>-A) \/A _{0<\/sub>]×100}}

式中：A和A_{0<\/sub>分别表示加入抑制物和双蒸水后的邻苯三酚的自氧化速率,即每分钟光吸收的平均变化率。}

4、ACE 抑制活性的测定

在 500 µL 离心管中依次加入50 µL 6.5 mmol\/L HHL 和 20 µL 样品，于 37℃水浴锅中预热 5 min，取出加入 20 µLACE 酶，再置于 37℃ 水浴锅中反应 1 h。反应结束后加入 50 µL 1mol\/L HCl 终止反应，继续加入 300 µL 乙酸乙酯，充分混匀后于 1000×rpm 下离心 5 min，吸取 200 µL 乙酸乙酯抽提液于 1.5 m L 离心管中，采用真空浓缩装置挥发除去乙酸乙酯，并加入 600 µL 去离子水充分溶解，2000×rpm 离心 3 min 后在228 nm 下测定吸光度值。其中，对照样用去离子水代替样品，空白样在加入 ACE 酶之前先加 HCl，其余条件不变。

ACE 的计算方法：

ACE 抑制率（%）=[1-(A _{样<\/sub>-A_{样空)<\/sub>\/(A_{对<\/sub>-A_{对空<\/sub>)]×100}}}}

式中：A_{样<\/sub>为样品所测吸光值；}

A_{样空<\/sub>为样品空白样所测吸光值；}

A_{对<\/sub>为对照样所测吸光值；}

A_{对空<\/sub>为对照空白组所测吸光值。}

表1各种过滤膜对过滤产物的抗氧化性和ACE抑制率的影响

由表1看出，过滤膜对过滤物的抗氧化性和ACE抑制率有明显作用，实施例1相对于对比例在过滤物的抗氧化性和ACE抑制率也有显著提高，表明甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜起到很好的过滤效果，·OH 清除率到达54.26%，DPPH·清除率达到了31.69%，超氧阴离子自由基清除率到达了77.54%，ACE抑制率到达了87.23%，经过喷雾干燥能得到抗氧性和高活性的牡蛎肽产品。

对比例4

该对比例4为牡蛎肽的制备方法，具体步骤参照实施例2，与实施例2不同之处在于，没有采用超频技术，只采用甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜。

对比试验二

本对比试验是对实施例2与对比例1、5进行膜通量试验。

分别取未过滤样品液，后装入储液槽。调节温度、压强和振幅，分别启动安装有实施例2、对比例1和5过滤膜的超频振动过滤机械系统，待机械运行稳定约5分钟后开始收集滤液，并每2分钟测定一次过滤通量，至完成过滤，对每次试验的过滤通量按照下列公式进行计算：

膜通量 J（L\/m ^{2<\/sup>·min）= 过滤液体积（L）\/[膜的面积（m ^{2<\/sup>）x测量时间（min）]}}

表2不同过滤技术和不同膜的通量考察结果

表2表明，（这个地方请补充数据的直观描述，比如各个对比例和实施例的对比情况，尽量不直接给出最后的结论）采用超频超膜技术，膜的通量明显好于只采用超滤技术，而且超频超滤技术和甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜能起到很好的配合作用，平均通量达到2216 L\/m ^{2<\/sup>·min。}

实施例3

本发明实施例提供了一种牡蛎肽的制备方法，该制备方法参照实施例1，但与实施例1不同之处在于，增加了喷雾干燥，包装储存步骤，具体为：

喷雾干燥步骤为：打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾，进口温度为 160℃，雾化器为 300Hz，蠕动泵转速为14rpm；包装储存步骤包括：包装将喷雾干燥的牡蛎肽用食品级聚乙烯 PE 塑料袋进行包装，封口以隔氧防潮，成品置于4℃冰箱保藏。

实施例4

本发明实施例提供了一种牡蛎肽的制备方法，该制备方法参照实施例2，但与实施例2不同之处在于，增加了喷雾干燥，包装储存步骤，具体为：

上述喷雾干燥步骤为：打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾，进口温度为180℃，雾化器为360Hz，蠕动泵转速为20rpm；上述包装储存步骤包括：包装将喷雾干燥的牡蛎肽用食品级聚乙烯 PE 塑料袋进行包装，封口以隔氧防潮，成品置于6℃冰箱保藏。

对比例5

本发明实施例提供了一种牡蛎肽的制备方法，该制备方法参照对比例1，但与对比例1不同之处在于增加了喷雾干燥，包装储存步骤，具体为：

对比例6

本发明实施例提供了一种牡蛎肽的制备方法，该制备方法参照对比例4，但与对比例4不同之处在于增加了喷雾干燥，包装储存步骤，具体为：

试验三

根据以上实施例3、4与对比例5、6,进行得肽率试验：

称取牡蛎干物质质量，称取获得牡蛎肽喷雾干燥样品质量，得到成品得率为。

成品得肽率公式：

成品得肽率（%）=（牡蛎干物质质量\/喷雾干燥样品质量）X100

表3采用不同过滤膜和过滤技术的成品得率

从表3可以看出，对比例5只用醋酸纤维膜时成品得肽率为73.2%，实施例3用的是甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜成品得肽率为79.3%，所以甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜能提高成品得肽率。对比例6只用超滤过滤技术得肽率较低只有56.8%，而实施例3的成品得肽率为79.3%，实施例4的成品得肽率为82.6%，都表明使用超频超滤技术有效提升得肽率，而且超频超滤技术和甲壳素\/氧化石墨烯\/醋酸纤维复合膜的配合也能有效提升得肽率。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

设计图

一种牡蛎肽的制备方法论文和设计

一种牡蛎肽的制备方法论文和设计-姜乃义

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主设计要求

设计方案

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