高效表达双基因的重组新城疫病毒的构建

论文摘要

溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒;能特异性识别并感染肿瘤细胞;最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞;但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用;理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。新城疫病毒作为一种新型的病毒载体可以通过表达外源基因来发挥抗肿瘤作用,如通过表达促凋亡蛋白增加肿瘤细胞的凋亡水平、通过抑制先天性免疫反应和增加融合能力来增加病毒复制能力和细胞间传递能力、通过表达肿瘤相关性抗原来激活肿瘤特异性淋巴细胞、通过表达抗肿瘤抗体来激活抗体依赖性细胞调控的细胞毒性反应、通过表达细胞因子来激活和招募淋巴细胞和树突状细胞等。研究发现,利用重组新城疫病毒载体（rNDV）同时表达两种外源基因可以共同调控病毒的溶瘤活性,并且溶瘤活性优于单独表达单个外源基因的效果,此外,外源基因的插入位点影响外源蛋白的表达水平,进而影响重组病毒的抗肿瘤活性。然而,rNDV表达两种外源基因时外源基因插入位点的最佳组合方式尚不清楚。本研究采用rClone30弱毒株为病毒骨架构建了表达单荧光蛋白基因的重组病毒质粒和表达双荧光蛋白基因的重组病毒质粒,通过反向遗传学操作技术平台,拯救了具有感染性的表达单荧光蛋白的重组病毒和表达双荧光蛋白的重组病毒,重组病毒经鉴定和性质测定后转染四种肿瘤细胞,采用免疫荧光实验和流式细胞术检测荧光蛋白的表达水平,通过荧光强度的差异判定外源基因的表达水平,同时探讨rNDV表达两种外源基因时的外源基因插入位点的最佳组合方式。实验结果如下:根据新城疫病毒基因组中位点选择的差异,采用rClone30弱毒株为病毒骨架,通过病毒图谱选择合适的酶切位点,构建了在NP/P位点和/或P/M位点插入外源荧光蛋白基因EGFP或RFP的重组病毒质粒;采用脂质体3000转染试剂摸索转录质粒和辅助质粒的比例,通过反向遗传学操作技术平台,拯救了具有感染性的表达可EGFP和/或RFP的重组病毒;通过提取重组病毒的RNA,采用RT-PCR实验,证实了重组病毒中外源基因的稳定存在;获得的表达单外源基因的重组新城疫病毒包括rClone30-EGFP（NP/P）、rClone30-EGFP（P/M）和rClone30-RFP（P/M）,表达双外源基因的重组新城疫病毒包括rClone30-EGFP（NP/P）-RFP（P/M）和rClone30-RFP-EGFP（P/M）。通过重组病毒凝集鸡红细胞、感染鸡成纤维细胞、感染SPF鸡胚和感染雏鸡,采用HA、TCID50、EID50、MDT和ICPI实验证实拯救的重组病毒在病毒滴度,病毒毒力和病毒致病力等指标上仍为弱毒株;通过绘制并比较重组病毒与亲本病毒的生长曲线证实重组病毒与亲本病毒具有相似的生长动力学;结果表明,所构建的5种重组新城疫病毒在生长动力学和分子生物学特性上与亲本病毒无显著差异。体外培养了四种肿瘤细胞HepG2、A549、Hela和U251,将5种重组新城疫病毒分别转染上述四种肿瘤细胞,通过免疫荧光实验和流式细胞术实验检测重组病毒中外源蛋白EGFP蛋白和/或RFP蛋白的表达水平,通过荧光蛋白荧光强度的差异证实在转染的四种肿瘤细胞中重组病毒rClone30-EGFP（NP/P）-RFP（P/M）和rClone30-RFP-EGFP（P/M）中荧光蛋白的表达水平均显著高于rClone30-EGFP（NP/P）、rClone30-EGFP（P/M）和rClone30-RFP（P/M）中的表达水平,而重组病毒rClone30-EGFP（NP/P）-RFP（P/M）中外源荧光蛋白的表达水平高于rClone30-RFP-EGFP（P/M）中的表达;同时发现,所构建的5种重组病毒在肝癌细胞HepG2中外源基因的表达水平均高于相似其他三种细胞（A549、Hela和U251）中的表达水平。结果表明,在外源基因的表达水平上表达双基因的重组病毒优于表达单基因的重组病毒,在外源基因的插入位点上两种外源基因分别插入在NP/P位点和P/M位点时外源蛋白的表达水平最高。如上所述,本研究成功构建并拯救了表达单外源基因和表达双外源基因的重组新城疫病毒;重组新城疫病毒与亲本病毒相比具有相似的生长动力学和生物学特性;确定了rNDV表达两种外源基因时外源基因的最佳插入位点为NP/P位点插入EGFP同时P/M位点插入RFP。本研究为进一步通过有效表达多种外源基因从而增强重组新城疫病毒的抗肿瘤活性研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
•   1.1 癌症与癌症治疗
•   1.2 溶瘤病毒
•   1.3 新城疫病毒的概述
•     1.3.1 新城疫病毒的分类
•     1.3.2 新城疫病毒的基因组结构
•   1.4 新城疫病毒的溶瘤机制
•   1.5 利用反向遗传学操作技术拯救重组新城疫病毒
•     1.5.1 反向遗传学操作技术
•     1.5.2 重组新城疫病毒的拯救
•   1.6 新城疫病毒抗肿瘤的优势
•   1.7 基因修饰的重组新城疫病毒
•   1.8 新城疫病毒的临床研究
•   1.9 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 质粒、病毒和细胞
•     2.1.2 仪器、设备和试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因克隆及序列比对分析
•     2.2.2 表达EGFP或 RFP基因的r Clone30 基因组全长c DNA的构建
•     2.2.3 同时表达EGFP和 RFP基因的r Clone30 基因组全长c DNA的构建
•     2.2.4 重组新城疫病毒的拯救和鉴定
•     2.2.5 重组新城疫病毒的RT-PCR鉴定
•     2.2.6 重组新城疫病毒的增殖曲线测定
•     2.2.7 重组新城疫病毒的滴度、毒力和致病力的测定
•     2.2.8 免疫荧光检测重组新城疫病毒感染不同肿瘤细胞后荧光蛋白的表达量
•     2.2.9 流式细胞术检测重组新城疫病毒感染不同肿瘤细胞后荧光蛋白的表达量
•     2.2.10 统计分析方法
• 3 结果与分析
•   3.1 连接单荧光蛋白基因的重组病毒质粒的鉴定
•   3.2 连接双荧光蛋白基因的重组病毒质粒的鉴定
•   3.3 重组新城疫病毒的拯救
•   3.4 重组新城疫病毒的RT-PCR鉴定
•   3.5 重组新城疫病毒的增殖稳定性检测
•   3.6 重组新城疫病毒的生物学特性评估
•   3.7 免疫荧光实验检测重组新城疫病毒感染不同肿瘤细胞后荧光蛋白的表达水平
•     3.7.1 重组新城疫病毒感染人肝癌细胞系HepG2 后荧光蛋白的表达
•     3.7.2 重组新城疫病毒感染人肺癌细胞系A549 后荧光蛋白的表达
•     3.7.3 重组新城疫病毒感染人肺癌细胞系Hela后荧光蛋白的表达
•     3.7.4 重组新城疫病毒感染人肺癌细胞系U251 后荧光蛋白的表达
•   3.8 流式细胞术检测重组新城疫病毒感染不同肿瘤细胞后荧光蛋白的表达水平
•     3.8.1 重组新城疫病毒感染人肝癌细胞系HepG2 后荧光蛋白的表达
•     3.8.2 重组新城疫病毒感染人肺癌细胞系A549 后荧光蛋白的表达
•     3.8.3 重组新城疫病毒感染人宫颈癌细胞系Hela后荧光蛋白的表达
•     3.8.4 重组新城疫病毒感染人胶质瘤细胞系U251 后荧光蛋白的表达
• 4 讨论
•   4.1 新城疫病毒的应用
•   4.2 新城疫病毒的基因组结构
•   4.3 重组新城疫病毒的拯救
•   4.4 提高新城疫病毒抗肿瘤活性的策略
•   4.5 重组新城疫病毒同时表达两种外源基因可以共同调控病毒的溶瘤活性
•   4.6 重组新城疫病表达两种外源基因时的外源基因插入位点的最佳组合方式
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高超

导师: 肖莉杰

关键词: 新城疫病毒,外源基因,插入位点,反向遗传学,抗肿瘤

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

分类号: S852.65

总页数: 85

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