杜氏盐藻β-胡萝卜素合成过程中小RNA预测、鉴定与功能分析

论文摘要

MicroRNAs（miRNAs）是一类长约21-24个核苷酸（nt）的内源性非编码RNA。作为一类保守的转录后调控分子,它们在生物细胞基因表达调控的过程中发挥重要作用。杜氏盐藻是一类缺乏刚性细胞壁的光合嗜盐藻类,能适应多种极端环境,尤其是高光和高盐。当杜氏盐藻在该环境中生存时,细胞内以脂质球的形式积累大量β-胡萝卜素,起重要的保护作用。为探明miRNA是否参与调控杜氏盐藻胞内β-胡萝卜素的积累,本研究利用高通量测序技术分析了高光高盐胁迫处理前后杜氏盐藻（Dunaliella salina）CCAP19/18小RNA表达谱,鉴定出一系列差异的miRNAs,并预测其靶基因。其中miRNA novel-m0533-3p可能通过抑制其靶基因的方式促进类胡萝卜素合成。具体研究结果如下:1.通过透射电子显微镜观察杜氏盐藻细胞,结果显示处理组中β-胡萝卜素脂质球数量为对照组的4倍,说明高光高盐胁迫处理后,杜氏盐藻β-胡萝卜素含量显著上升。进一步高效液相色谱检测表明,在高光高盐胁迫处理下,杜氏盐藻胞内β-胡萝卜素含量从44.90 mg/g增加到305.63 mg/g微藻细胞干重;2.利用高通量测序技术分析处理前后的杜氏盐藻小RNA表达谱,分别获得了11,542,169和16,877,598条clean tags。结果显示杜氏盐藻小RNA长度主要分布在21 nt,并且其首位核苷酸明显偏好尿嘧啶（U）;3.通过对杜氏盐藻小RNA表达谱分析,本研究发现了84个已知miRNAs（known miRNAs）和1054个未知miRNAs（novel miRNAs）。其中,9个known miRNAs和39个novel miRNAs的表达水平在高光高盐胁迫处理后发生显著改变（其中32个差异miRNAs表达上调,16个差异miRNAs表达下调）。MiRNAs靶基因的预测、注释和富集表明,杜氏盐藻miRNA可能存在多个预测靶基因,差异表达miRNAs的靶基因与生物和分子功能过程有关。其中,参与结合过程的靶基因最多,其次是催化活性过程、细胞过程和代谢过程;4.利用qRT-PCR对24个随机挑选的miRNAs进行验证,结果显示17个miRNAs在对照组和处理组中可被成功检测,其中5个miRNAs在处理组中表达水平显著上调。特别是novel-m0857-5p和novel-m0533-3p,在处理组中表达水平分别上调7.47倍和3.83倍。与此对应的是,novel-m0783-5p的四个预测靶基因表达水平分别下调71.72%、57.01%、53.14%和42.93%,novel-m0533-3p的预测靶基因表达水平下调68.88%;5.利用Western blot技术检测了novel-m0533-3p的靶基因苹果酸脱氢酶的蛋白表达水平,发现苹果酸脱氢酶蛋白表达水平下降。结合qRT-PCR结果,间接说明miRNA novel-m0533-3p对靶基因起到剪切作用;6.利用qRT-PCR分析了类胡萝卜素代谢通路关键基因的表达水平,发现在处理组中,PSY、PDS和LCYB表达水平均上调。尤其是PSY,与对照组相比提高了17倍,说明类胡萝卜素代谢途径显著加强;综上,杜氏盐藻在高光高盐胁迫下积累β-胡萝卜素且存在miRNA参与β-胡萝卜素的代谢途径。本研究初步阐释了miRNA参与杜氏盐藻β-胡萝卜素积累的分子调控机制,为探索利用基因调控手段提高杜氏盐藻β-胡萝卜素的含量提供新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 miRNA的概述
•     1.1.1 miRNA的作用方式
•       1.1.1.1 动物miRNA作用机制
•       1.1.1.2 植物miRNA作用机制
•     1.1.2 微藻miRNA的研究现状
•   1.2 杜氏盐藻
•     1.2.1 杜氏盐藻简介
•     1.2.2 杜氏盐藻积累β-胡萝卜素的机制
•     1.2.3 杜氏盐藻的产业化
•     1.2.4 杜氏盐藻的组学研究
•   1.3 β-胡萝卜素生物合成
•     1.3.1 β-胡萝卜素的简介
•     1.3.2 杜氏盐藻β-胡萝卜素生物合成途径
•   1.4 本研究的目的、意义及技术路线
• 第2章 杜氏盐藻细胞形态及β-胡萝卜素含量变化
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验藻株
•     2.1.2 主要化学试剂
•     2.1.3 主要实验仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 培养基配制
•     2.2.2 绘制杜氏盐藻生长曲线
•       2.2.2.1 标准曲线制作
•       2.2.2.2 生长曲线制作
•     2.2.3 盐藻细胞装片制作
•     2.2.4 高效液相色谱检测杜氏盐藻β-胡萝卜素含量
•       2.2.4.1 样品处理
•       2.2.4.2 配制标准工作溶液
•       2.2.4.3 色谱条件
•       2.2.4.4 HPLC检测方法
•       2.2.4.5 β-胡萝卜素含量计算
•     2.2.5透射电子显微镜实验
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 杜氏盐藻生长曲线的测定
•     2.3.2 在高光高盐胁迫条件下盐藻细胞生长情况
•     2.3.3 杜氏盐藻β-胡萝卜素含量测定
•       2.3.3.1 β-胡萝卜素标准曲线
•       2.3.3.2 定性分析
•       2.3.3.3 定量分析
•     2.3.4 透射电子显微镜观察胁迫前后盐藻细胞
•   2.4 实验讨论
•   2.5 本章小节
• 第3章 杜氏盐藻在高光高盐胁迫下小RNA组学测序
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验藻株
•     3.1.2 主要化学试剂
•     3.1.3 主要实验仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 样品处理
•     3.2.2 杜氏盐藻CCAP19/18小RNA建库和高通量测序
•     3.2.3 杜氏盐藻CCAP19/18小RNA测序数据分析
•       3.2.3.1 原始数据处理
•       3.2.3.2 鉴定known miRNAs
•       3.2.3.3 鉴定novel miRNAs
•       3.2.3.4 miRNA靶基因预测与靶基因富集分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 杜氏盐藻小RNA测序分析
•     3.3.2 杜氏盐藻miRNA的鉴定与分离
•       3.3.2.1 杜氏盐藻known miRNAs和novel miRNAs的鉴定
•       3.3.2.2 novel miRNAs二级结构分析
•       3.3.2.3 杜氏盐藻miRNAs首位碱基偏好性
•       3.3.2.4 杜氏盐藻MIR基因在基因组上的分别
•     3.3.3 分析杜氏盐藻差异表达的miRNAs
•     3.3.4 杜氏盐藻差异miRNAs靶基因及其代谢通路预测
•   3.4 本章讨论
•   3.5 本章小结
• 第4章 qRT-PCR验证差异表达miRNAs及其预测靶基因
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验藻株
•     4.1.2 主要化学试剂
•     4.1.3 主要实验仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 样品处理
•     4.2.2 杜氏盐藻小RNA提取方法
•     4.2.3 杜氏盐藻小RNA反转录方法
•     4.2.4 杜氏盐藻miRNA的qRT-PCR实验
•       4.2.4.1 杜氏盐藻miRNA稳定内参基因筛选
•       4.2.4.2 差异miRNAs的qRT-PCR验证
•       4.2.4.3 差异miRNAs预测靶基因验证
•     4.2.5 qRT-PCR验证杜氏盐类胡萝卜素代谢途径过程中关键基因表达水平
•     4.2.6 Western Blot检测苹果酸脱氢酶的蛋白表达水平
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 杜氏盐藻小RNA电泳图
•     4.3.2 杜氏盐藻小RNA qRT-PCR内参基因筛选
•     4.3.3 差异miRNAs的qRT-PCR实验结果
•     4.3.4 差异miRNAs预测靶基因qRT-PCR实验结果
•     4.3.5 杜氏盐藻类胡萝卜素代谢途径关键基因表达水平
•     4.3.6 Western Blot检测苹果酸脱氢酶的蛋白表达水平
•   4.4 本章讨论
•   4.5 本章小结
• 第5章 结论与展望
•   5.1 实验结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱秀兰

导师: 李辉

关键词: 绿藻,杜氏盐藻,胡萝卜素,基因调控

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 深圳大学

分类号: Q943.2

总页数: 85

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