介导线虫对苏云金杆菌晶体蛋白毒素免疫应激反应信号通路PMK-2作用靶标的研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌产生的伴胞晶体蛋白具有很好的杀虫效果,其中Cry5B和Cry6A较为典型。Cry6A在结构上与其他的伴胞晶体蛋白有较大不同,且作用机制新颖。新颖的作用方式预示着线虫可能对该毒素存在不同的免疫应激反应机制。在秀丽隐杆线虫体内存在三个pmk基因pmk-（1-3）,它们连续排列组成一个操纵子;而PMK-2与PMK-1同源性很高,主要表达于线虫神经细胞中。我们前期研究结果显示PMK-2与秀丽隐杆线虫对Cry6A晶体蛋白毒素防御反应相关,对线虫生存具有重要意义。基于上述研究基础,本课题对有无Cry6A毒素作用野生型秀丽隐杆线虫的转录组进行了比较分析,进一步筛选PMK-2信号途径调控的靶标基因,从而揭示PMK-2信号通路介导线虫对Cry6A晶体蛋白防御反应的分子机制。PMK-1能被上游激酶NSY-1和SEK-1所激活,且pmk-1和pmk-2位于同一操纵子上,本实验首先通过Western blotting证明Cry6A不能使突变体sek-1（km4）和nsy-1（ag3）的PMK-2发生磷酸化,说明NSY-1和SEK-1也是磷酸化激活PMK-2的上游激酶。已有研究表明在受到Cry5B毒素作用时,秀丽隐杆线虫会通过PMK-1途径来调节ttm-1和ttm-2靶标基因的表达。本实验中通过RNAi技术沉默秀丽隐杆线虫ttm-2基因,用Cry6A对ttm-1,ttm-2这两个基因的突变体进行敏感性测定发现这两个突变株对Cry6A的敏感性不变,表明PMK-2不与PMK-1共用下游靶标TTM-1和TTM-2。本实验还利用RNA-seq技术对有无Cry6A毒素作用野生型秀丽隐杆线虫的转录组进行了比较分析,对PMK-2调控的一些途径进行了初步的探讨。从中筛选了11种差异基因并用qRT-PCR技术鉴定其在转录水平上的变化,发现防御Cry6Aa2毒素时,秀丽隐杆线虫会启动热休克蛋白（HSP-70）来提高自身的应激反应能力;脂肪代谢,药物代谢-细胞色素P450等一些与能量代谢有关的途径在线虫抵御Cry6A毒素过程中也会发生变化来为其自身提供一定能量;同时还激活了五种与天然免疫反应相关的蛋白。这些与能量相关蛋白的表达可以为机体提供能量从而激活天然免疫来抵御毒素的攻击,而这些能量可能来源于糖酵解途径,三羧酸循环和无脊椎动物中特有的精氨酸激酶途径。在毒素与宿主之间的战斗中,MAPK可能感受毒素引起的能量失衡,激活MAPK,进而调控下游多个防御反应,达到抵御病原菌或毒素的目的。综上所述,本研究丰富了p38 MAPK信号转导途径的多样性,有助于我们深入了解线虫这一模式生物在自然条件下的先天免疫机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1 秀丽隐杆线虫
•   2 苏云金芽胞杆菌杀虫活性研究
•   3 秀丽隐杆线虫免疫应答调控系统
•     3.1 MAPK信号转导通路
•     3.2 胰岛素样信号通路
•     3.3 TGF-β信号转导通路
•   4 线虫对Bt晶体蛋白毒素免疫应激反应
•   5 立题依据及意义
• 第二章 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 供试菌株
•     1.2 秀丽隐杆线虫
•     1.3 载体
•     1.4 培养基
•     1.5 抗体
•     1.6 PCR引物合成
•     1.7 试剂盒和相关试剂
•       1.7.1 试剂盒
•       1.7.2 相关溶液配制
•     1.8 主要仪器设备
•   2 实验方法
•     2.1 Cry6A毒素对秀丽隐杆线虫PMK-1/2 磷酸化水平的影响
•       2.1.1 Bt杀虫晶体蛋白Cry6A、Cry5B的纯化
•       2.1.2 毒素作用线虫处理
•       2.1.3 Western blot检测磷酸化水平
•     2.2 PMK-2 蛋白的可溶性检测
•       2.2.1 PMK-2 蛋白诱导表达
•       2.2.2 菌体的超声破碎
•       2.2.3 SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的可溶性
•     2.3 ttm-2 突变体构建
•       2.3.1 C.elegans总 RNA的提取
•       2.3.2 ttm-2 基因干扰载体的构建
•       2.3.3 ttm-2 基因的RNA干扰实验
•       2.3.4 RNAi线虫ttm-2 基因干扰效果检测
•     2.4 Cry6A,Cry5B对 ttm-1,ttm-2 突变体的毒力敏感测定
•     2.5 Cry6A对野生型秀丽隐杆线虫的转录组测序分析
•       2.5.1 Cry6A蛋白诱导表达
•       2.5.2 Cry6A蛋白作用于野生型线虫
• 第三章 结果与分析
•   1 Cry6A晶体蛋白毒素对秀丽隐杆线虫突变体PMK-1/2磷酸化水平的影响
•     1.1 Cry6A,Cry5B晶体蛋白的提取纯化
•     1.2 sek-1和nsy-1是PMK-2 上游激酶
•   2 PMK-2 蛋白的可溶性检测
•     2.1 PMK-2 蛋白诱导表达
•     2.2 PMK-2 蛋白的可溶性鉴定
•   3 秀丽隐杆线虫ttm-2 基因的RNA干扰
•     3.1 秀丽隐杆线虫总RNA的提取
•     3.2 ttm-2 基因的RNA干扰载体的构建
•     3.3 ttm-2 重组菌株喂食线虫
•     3.4 ttm-2 基因干扰效果
•   4 Cry6A,Cry5B晶体蛋白对野生型N2及ttm-1,ttm-2 突变体的毒力作用
•   5 Cry6A毒素处理野生型秀丽隐杆线虫RNA-seq数据分析
•     5.1 Cry6A蛋白的诱导表达
•     5.2 Cry6A对秀丽隐杆线虫生长情况的影响
•     5.3 秀丽隐杆线虫总RNA的提取与质量检测
•     5.4 秀丽隐杆线虫转录组测序质量检测
•     5.5 秀丽隐杆线虫转录组测序差异基因表达分析
•     5.6 秀丽隐杆线虫在Cry6A毒素处理下差异表达基因GO分类
•     5.7 秀丽隐杆线虫在毒素处理条件下的KEGG pathway分析
•     5.8 差异基因的功能分析
•   6 利用q RT-PCR技术检测差异基因在转录水平上的差异
•     6.1 pmk-2 基因干扰效果检测
•     6.2 利用qRT-PCR检测处理和对照组秀丽隐杆线虫中11 种差异基因转录情况
•     6.3 Cry6A使秀丽隐杆线虫ATP含量上升
•     6.4 Cry6A对秀丽隐杆线虫突变体的毒力作用
• 第四章 讨论
•   1 Cry6A对秀丽隐杆线虫的作用
•   2 MAPK下游调控多种能量相关蛋白
•   3 秀丽隐杆线虫能量代谢分析
• 第五章 结论
•   1 PMK-2与PMK-1共用上游激酶SEK-1和NSY-1
•   2 PMK-2 不与PMK-1 共用下游靶标TTM-1和TTM-2
•   3 通过RNA-seq确定了一些与秀丽隐杆线虫防御Cry6Aa2 毒素相关的途径和蛋白
• 参考文献
• 论文发表情况
• 课题受资助的基金项目
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邬欢

导师: 余子全

关键词: 苏云金芽胞杆菌,毒素,秀丽隐杆线虫,靶标,天然免疫反应

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖南师范大学

基金: 苏云金杆菌Cry6A与秀丽小杆线虫相互作用研究(2015JJ2098),湖南省2015年自然科学基金面上项目

分类号: Q93

总页数: 66

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