花花柴表皮蜡质的合成及其对植物耐高温的研究

论文摘要

脂肪酸生物合成系统是植物抵御外界胁迫的重要因素之一,植物可以通过调节自身脂肪酸合成来应对各种逆境。植物表皮蜡质是由脂肪酸、烷烃、醇类等物质组成的一类有机混合物,不仅具有保水、清洁、防止病原危害以及外力损伤等作用,还可以抵御紫外辐射、高温、冷害等外界环境的胁迫。温度是影响植物分布的主要环境因素之一,高温胁迫不仅影响植物的生长、发育,还严重地影响植物繁殖。为阐明表皮蜡质的合成与花花柴（Karelinia capsia）耐高温之间的关系,本研究测定了不同条件下荒漠植物花花柴叶片表皮蜡质的合成与积累,分析了高温条件下脂肪酸生物合成转录组及其差异表达基因,预测了脂肪酸生物合成关键酶KcFabZ基因的功能并构建了超表达载体,主要得出以下结果:（1）花花柴叶片表皮蜡质的提取及分析对花花柴叶表皮蜡质进行正交试验设计、方差分析和电镜扫描观察发现,提取温度对提取结果影响最大,其次是提取时间、提取液和提取材料影响,综合各处理叶片表皮蜡质的涵盖比率、叶片褶皱程度和气孔周围蜡质提取效率,提取条件为加热60℃三氯甲烷时提取效果最佳。对提取的蜡质进行分析检测发现其主要成分为烷烃类化合物;在高温40℃下处理的样品,随着高温处理时间的增长,烷烃总含量增加,在处理到24小时后,烷烃总含量最高,约为未处理材料的6倍,在高温处理到72小时后,烷烃总含量骤降,但仍然是未处理材料的2倍多,推测是由于花花柴在长时间高温胁迫下调节叶表皮蜡质含量来自我保护的一种机制;对苗期花花柴叶片蜡质含量进行比较发现,人工绿地花花柴叶片蜡质烷烃总含量是室内培养花花柴叶片蜡质的10倍,野外沙漠花花柴叶片蜡质的烷烃总含量是室内培养花花柴叶片蜡质的18倍;对人工绿地和野外沙漠环境下的花花柴叶片蜡质烷烃总含量进行对比,发现两种野外环境生长下的花花柴叶片蜡质烷烃总含量较高,当处于高温状态下一段时间后,含量显著降低,进一步验证花花柴用过调节表皮蜡质的含量来响应高温胁迫。（2）花花柴高温下脂肪酸生物合成转录组分析及相关基因的表达模式分析在花花柴常温-高温RNA-seq转录组发现共有11个脂肪酸合成基因差异表达,主要分为三大类,第一类是是控制脂肪酸生物合成的限速酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因家族,主要是催化乙酰-CoA,第二类是主要负责碳链的还原和脱水的脂肪酸合酶（Fab）家族基因,第三类是负责终止碳链延长的脂酰-ACP硫酯酶（Fat）家族基因,通过同源性分析,这三类基因与向日葵（Helianthus annuus）、莴苣（Lactuca sativaLinn）、刺菜蓟（Cynara cardunculus）等物种同源性较高,都达到60%以上且与莴苣亲缘性最高;在对部分基因进行表达模式分析中,发现各基因对高温处理都有差异表达,趋势略有不同:在高温处理下,基因KcACC中表现出降低-升高-降低的趋势,基因KcFabZ、KcFatB中表现出降低-升高-降低-升高的趋势,基因KcFabG5中表现出升高-降低的趋势,基因KcFabG6中表现出升高-降低-升高-降低-升高的趋势;通过与蜡质相关的路径差异表达基因蛋白质互作关系分析发现,脂肪酸生物合成基因与其相关路径基因发生直接蛋白互作关系。（3）KcFabZ基因的功能预测及超表达载体构建KcFabZ基因CDS全长为669 bp,定位在叶绿体中,叶绿体是质体的一种,蜡质合成的第一步是在质体中合成长度为C16C18的脂肪酸,第二步在内质网中长链脂肪酸进行碳链的延伸,第三步是超长链脂肪酸在内质网的修饰下形成醇类、酯类和烷烃等,故推测该基因与其叶表面蜡质积累有关;系统发育结果显示KcFabZ与菊科的莴苣的该基因同源性达到89%;根据NCBI中保守结构域及3D结构预测,KcFabZ为hotdog超家族功能基因,具有典型的高保守α+β‘hotdog’折叠;荧光定量PCR结果显示,KcFabZ表现在高温处理下随着处理时间的延长表达量先升高后降低,高温处理8小时表达量达到最大值,为对照的19.54倍,结果表明,KcFaZ基因的表达与高温处理有关。本研究结果表明,花花柴表皮蜡质在三氯甲烷加热60秒下提取为最佳提取方法;花花柴表皮蜡质主要成分为烷烃类化合物;在长期高温胁迫下花花柴通过调节表皮蜡质含量来抵御高温,克隆的脂肪酸生物合成途径中唯一的脱水酶基因KcFabZ在高温处理下也表现出不同的表达量,这些为继续探究花花柴表皮蜡质在高温胁迫下的响应机制提供了基础,也为棉花等经济作物的耐高温育种提供参考依据和基因资源。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 概述
•   1.1 高温对植物的影响
•     1.1.1 高温对植物生长发育的影响
•     1.1.2 高温对植物生理生化的影响
•     1.1.3 高温对植物分子机制的影响
•   1.2 植物脂肪酸生物合成与植物抗逆性
•     1.2.1 脂肪酸生物合成与植物耐热性的关系
•     1.2.2 表皮蜡质与植物响应逆境胁迫的关系
•     1.2.3 脂肪酸生物合成关键基因研究进展
•   1.3 花花柴抗逆性研究进展
• 第2章 花花柴叶表皮蜡质的提取与分析
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 实验材料准备
•     2.1.5 实验方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 花花柴叶片表皮蜡质在高温处理下积累
•     2.2.2 花花柴不同月份下表皮蜡质积累
•     2.2.3 花花柴叶表皮蜡质提取体系建立
•     2.2.4 花花柴叶表皮蜡质组分分析
•   2.3 讨论
• 第3章 花花柴脂肪酸生物合成相关基因转录组与表达模式分析
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•     4.1.4 引物设计与合成
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 转录组分析
•     4.2.2 表达模式分析
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 脂肪酸生物合成差异表达基因转录组路径分析
•     4.3.2 脂肪酸生物合成差异表达基因系统发育分析
•     4.3.3 脂肪酸生物合成差异表达基因表达模式分析
•     4.3.4 脂肪酸生物合成差异表达基因蛋白质互作分析
•   4.4 讨论
• 第4章 KCFABZ基因的功能预测及超表达载体构建
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 主要试剂
•     5.1.3 主要仪器
•     5.1.4 引物设计与合成
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 RNA获取及CDNA合成
•     5.2.2 KCFABZ基因的PCR扩增
•     5.2.3 KCFABZ基因的PCR产物回收
•     5.2.4 KCFABZ基因克隆重组质粒
•     5.2.5 KCFABZ基因质粒提取
•     5.2.6 KCFABZ基因质粒酶切鉴定
•     5.2.7 KCFABZ超表达载体构建
•     5.2.8 KCFABZ基因生物信息学分析
•     5.2.9 KCFABZ荧光定量表达分析
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 RNA获取及CDNA合成
•     5.3.2 KCFABZ基因的PCR扩增
•     5.3.3 KCFABZ基因克隆鉴定结果
•     5.3.4 KCFABZ基因生物信息学分析
•   5.4 讨论
• 第5章 结论与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王磊

导师: 王彦芹

关键词: 高温胁迫,花花柴,脂肪酸,表皮蜡质

来源: 塔里木大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 塔里木大学

基金: 国家自然科学基金项目“基于 RNA-seq 沙漠花花柴高温胁迫响应分子机理研究”的部分研究成果(项目编号:31460071),课题主持人:王彦芹教授(塔里木大学)

分类号: Q945.78

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