屎肠球菌纤维素结合域谷氨酸脱羧酶构建及其酶学性质

论文摘要

为了开发可用于高效固定化的优质谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD,EC 4. 1. 1. 15）,以Enterococcus faecium GDMCC60203为gad B基因供体,对纤维素结合域（cellulose-binding domain,CBD） GAD融合酶（CBD-GAD）的构建及其酶学性质进行了探讨。结果显示:构建的含pRPOCB-Efagad B重组质粒的Escherichia coli GDMCC 60445可高效表达CBD-GAD,120 m L发酵液制备的纤维素固定化CBD-GAD的活力为（347. 93±27. 63） U/g;在无氨苄青霉素LB培养基中连续培养5批,E. coli GDMCC 60445仍可稳定表达CBD-GAD;经一步纯化,CBD-GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为74. 02 k Da; CBD-GAD最适反应p H和温度分别为4. 6和60℃,在p H 4. 8～5. 6和4～40℃较稳定,仅对L-谷氨酸具有催化活性,Km和Vmax分别为10. 58 mmol/L和3. 83μmol/（m L·min）,其催化反应不受底物和产物抑制。重组菌株稳定,CBD-GAD酶学性质优良,有望应用于γ-氨基丁酸和D-谷氨酸工业化生产。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与试剂
•   1.2 仪器与设备
•   1.3 实验方法
•     1.3.1 种子液的制备
•     1.3.2 E.faecium CBD-GAD重组大肠杆菌的构建
•       1.3.2. 1 E.faecium的gadB基因克隆
•       1.3.2. 2 CBD-GAD融合酶表达载体及重组大肠杆菌的构建
•       1.3.2. 3 CBD-GAD融合酶的表达
•       1.3.2. 4 CBD-GAD融合酶的提取与固定化
•       1.3.2. 5 RAC-CBD-GAD活性测定
•       1.3.2. 6 重组E.coli GDMCC 60445的稳定性
•     1.3.3 CBD-GAD融合酶的纯化
•     1.3.4 CBD-GAD纯酶的酶学性质研究
•       1.3.4. 1 CBD-GAD活性测定方法
•       1.3.4. 2 pH对CBD-GAD的影响
•       1.3.4. 3 温度对CBD-GAD的影响
•       1.3.4. 4 CBD-GAD底物特异性
•       1.3.4. 5 CBD-GAD动力学常数
•       1.3.4. 6 GABA对CBD-GAD活性的影响
•   1.4 数据分析
• 2 结果与分析
•   2.1 E.faecium CBD-GAD重组大肠杆菌的构建
•     2.1.1 gadB基因克隆
•     2.1.2 CBD-GAD融合酶表达载体及重组大肠杆菌的构建
•     2.1.3 CBD-GAD融合酶的表达
•     2.1.4 重组E.coli GDMCC 60445的稳定性
•   2.2 CBD-GAD融合酶的纯化
•   2.3 CBD-GAD纯酶的酶学性质
•     2.3.1 p H对CBD-GAD的影响
•     2.3.2 温度对CBD-GAD的影响
•     2.3.3 CBD-GAD底物特异性
•     2.3.4 CBD-GAD动力学常数
•     2.3.5 GABA对CBD-GAD活性的影响
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 杨胜远,林谦,赖丽萍,黄婷婷

关键词: 纤维素结合域,屎肠球菌,谷氨酸脱羧酶,表达,酶学性质

来源: 食品与发酵工业 2019年21期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学

单位: 岭南师范学院化学化工学院,玉林师范学院生物与制药学院

基金: 广东省自然科学基金项目(2014A030307039),岭南师范学院科研专项项目(ZL1602)

分类号: Q55

DOI: 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020312

页码: 22-30

总页数: 9

文件大小: 1591K

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