粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备

论文摘要

线粒体作为一种具有双层膜结构且能独立复制的细胞器,是细胞内合成ATP的主要场所。在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe,S.pombe）中,线粒体基因组（mtDNA）的表达对线粒体功能的发挥至关重要。mtDNA主要编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基,线粒体蛋白合成所需要的两个核糖体亚基和25种tRNA以及RNase P的RNA亚基（rnpB）。PPR蛋白含有2-30个PPR模体,该结构由简并的35个串联重复的氨基酸组成,可与RNA结合。在人和小鼠、植物和芽殖酵母等物种中,PPR蛋白参与了mtDNA编码的基因表达的转录和转录后调控。PPR蛋白与RNA特异结合,与RNA5′端成熟、内含子剪切、RNA编辑和稳定等密切相关。我们实验室报道Ppr10可以免疫共沉淀出Mpa1,以及Ppr10和Mpa1参与了线粒体蛋白质的翻译。但是不清楚Ppr10和Mpa1形成复合体的生理意义。本文针对上述问题开展了研究。首先利用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）方法检测Ppr10和Mpa1在活细胞内的相互作用,Western blotting和荧光显微镜观察实验结果表明Ppr10与Mpa1在体内存在直接相互作用。另一方面,体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的意义的关键是获得Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。本文利用粟酒裂殖酵母ESP?表达系统表达了Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。为得到Ppr10-Mpa1复合体,利用ESP?表达系统将ppr10和mpa1克隆到pESP2质粒上,实现蛋白Ppr10和Mpa1在粟酒裂殖酵母中共表达。利用FastPrep-24仪器和GST亲和层析柱纯化得到Ppr10-Mpa1复合体,复合体基本达到体外研究对于蛋白纯度的要求。作为对照实验,利用同样的方法在粟酒裂殖酵母中表达Ppr10并纯化GST-Ppr10。本文研究为后续体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的生理意义,如利用荧光热稳定性方法检测Mpa1是否促进Ppr10的稳定性打下了基础。粟酒裂殖酵母Atp4被预测为线粒体ATP合酶F0的组成蛋白,但是具体功能并不清楚。本文通过表型研究发现atp4敲除后菌株出现生长缺陷,荧光显微镜观察发现atp4定位于线粒体内。Atp4的缺失导致线粒体基因组编码的蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达水平急剧下降。以上研究说明atp4对线粒体蛋白表达量的稳定很重要。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 线粒体简介
•     1.1.1 结构与功能
•     1.1.2 线粒体的基因组
•   1.2 PPR蛋白
•   1.3 模式生物——粟酒裂殖酵母
•   1.4 蛋白质与蛋白质相互作用
•   1.5 蛋白质稳定性研究
•   1.6 研究内容和方法
• 第二章 双分子荧光互补法检测Ppr10和Mpa1 的体内相互作用
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌种
•     2.1.2 所用试剂及耗材
•     2.1.3 质粒
•     2.1.4 引物序列
•     2.1.5 培养基与试剂配制
•     2.1.6 仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 质粒的构建
•     2.2.2 制备大肠杆菌的感受态细胞
•     2.2.3 转化
•     2.2.4 醋酸锂转化
•     2.2.5 荧光显微镜观察
•     2.2.6 碱裂解法提取细胞总蛋白
•     2.2.7 Western blotting检测蛋白表达情况
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 双分子荧光实验质粒的构建
•     2.3.2 Western blotting检测不同菌株内蛋白Ppr10和Mpa1 表达情况
•     2.3.3 荧光显微镜检测BiFC质粒的功能
•   2.4 讨论
• 第三章 Ppr10和Mpa1 在裂殖酵母ESP?表达系统内表达与纯化
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株
•     3.1.2 质粒
•     3.1.3 引物序列
•     3.1.4 试剂和仪器
•     3.1.5 培养基与试剂配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 质粒的构建
•     3.2.2 诱导蛋白表达
•     3.2.3 Fastprep-24 提取细胞蛋白
•     3.2.4 GST亲和层析柱纯化蛋白
•     3.2.5 GST pull-down
•     3.2.6 碱裂解法提取蛋白
•     3.2.7 考马斯亮蓝染色
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 预测Ppr10和Mpa1 线粒体定位序列
•     3.3.2 粟酒裂殖酵母ESP?表达系统表达质粒的构建
•     3.3.3 平板划线初步检测Ppr10和Mpa1 蛋白表达情况
•     3.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳检测Ppr10和Mpa1 分别表达情况
•     3.3.5 Fastprep-24 破碎次数对蛋白提取效果的影响
•     3.3.6 GST亲和层析柱纯化蛋白GST-Ppr10
•     3.3.7 GST pull-down检测体外相互作用
•   3.4 讨论
• 第四章 Ppr10-Mpa1 复合体纯化
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 所用菌株
•     4.1.2 所用试剂及耗材
•     4.1.3 试剂配制
•     4.1.4 引物序列
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 共表达质粒构建技术路线
•     4.2.2 碱裂解法提取蛋白
•     4.2.3 GST标签纯化蛋白
•     4.2.4 GST pull-down
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 共表达质粒的构建
•     4.3.2 Ppr10和Mpa1 共表达
•     4.3.3 Ppr10与Mpa1 体外复合体的检测
•   4.4 讨论
• 第五章 粟酒裂殖酵母蛋白Atp4 定位和功能的研究
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 所用菌株和质粒
•     5.1.2 所用试剂和仪器
•     5.1.3 培养基与试剂配制
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 Atp4 定位预测分析
•     5.2.2 Δatp4 菌株构建
•     5.2.3 Δatp4 菌株生长表型研究
•     5.2.4 酵母线粒体提取
•     5.2.5 Western blotting检测Δatp4 和野生型菌株中线粒体蛋白表达量
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 Δatp4 菌株的表型研究
•     5.3.2 荧光显微镜观察Atp4 的定位
•     5.3.3 Δatp4 菌株中线粒体蛋白表达量降低
•   5.4 讨论
• 全文总结与讨论
• 参考文献
• 附录一 菌株
• 附录二 质粒
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李琴

导师: 黄鹰

关键词: 粟酒裂殖酵母,相互作用

来源: 南京师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京师范大学

分类号: Q78

DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001063

总页数: 64

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