鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及其ELISA试剂盒的研制

论文摘要

目前,我国江苏、重庆、福建、浙江、江西、山东等多省爆发鸭坦布苏病毒病,给我国养鸭业带来了严重经济损失。虽对该疫病的检测方法较多,但尚无商品化的检测试剂盒来方便快捷地检测DTMUV的感染。基于本实验室现有的CQW1株鸭坦布苏病毒（GenBank登录号:KM233707.1）的重组E蛋白,本研究制备出抗DTMUV单克隆抗体,并研制出检测试剂盒,为试剂盒的商业化发展奠定基础。1.DTMUV-E蛋白单克隆抗体的制备利用DTMUV-E蛋白作免疫抗原,通过杂交瘤技术,制备出两株杂交瘤细胞A6E7和D1D7。经辛酸-硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化,得到两株浓度分别为0.97mg/mL和1.09mg/mL的单克隆抗体A6E7和D1D7。亚类分析表明,两株单克隆抗体重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。间接IFA和WB试验分析显示,A6E7和D1D7均能特异性识别DTMUV,与GPV、DPV和DHAV-1均无交叉反应。通过分析单克隆抗体识别的抗原表位情况,结果表明A6E7和D1D7识别同一抗原表位。进一步分析单克隆抗体对E蛋白的相对亲和力,发现A6E7相对亲和力要大于D1D7,其能与E蛋白更好的反应。2.DTMUV-E蛋白抗体检测试剂盒的研究将单克隆抗体A6E7进行辣根过氧化物酶标记,制备出酶标单抗。进而包被E蛋白,建立了直接阻断ELISA方法。通过优化试验条件,结果表明E蛋白最适包被浓度为3.75μg/mL,血清和酶标单抗最佳稀释度分别为1:2和1:400,抗原最佳包被时间37℃2h,最佳封闭时间37℃1h,血清和酶标单抗最佳温育时间均为37℃1h,最佳显色时间10min。在此基础上,对试剂盒组分进行处理,制备并组装出试剂盒。特异性试验表明,对DHAV-1、DHAV-3、DPV、RA、DuCV阳性血清均无交叉反应发生。通过检测60份已知背景的鸭血清样品,该试剂盒检测准确率100%,其敏感性良好。重复性试验和稳定性试验分析表明,该试剂盒重复性好,能在4℃条件下稳定保存7个月。检测324份临床鸭血清样品,并与已报道的间接ELISA方法进行对比,结果表明试剂盒检测的阴性结果符合率为94.96%,阳性结果符合率为75.76%,比较两种方法符合率为91.05%。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
•   1 鸭坦布苏病毒E蛋白的研究进展
•     1.1 E蛋白结构特点
•       1.1.1 E蛋白的调控中枢
•       1.1.2 DⅡ和DⅢ的反抑制作用
•     1.2 E蛋白的功能
•       1.2.1 介导病毒感染宿主细胞
•       1.2.2 诱导宿主产生中和抗体
•       1.2.3 诱发程序性细胞死亡
•     1.3 应用
•       1.3.1 疾病检测
•       1.3.2 疫苗
•   2 酶联免疫吸附测定法概述
•     2.1 分类
•     2.2 技术特点
•     2.3 在DTMUV检测上的应用
•   3 研究目的和意义
• 第二部分 试验研究
•   第一章 鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备
•     1 材料
•       1.1 病毒
•       1.2 免疫蛋白和实验动物
•       1.3 主要仪器
•       1.4 主要试剂
•       1.5 溶液配制
•     2 方法
•       2.1 动物免疫
•       2.2 间接ELISA方法的建立
•       2.3 杂交瘤细胞的制备
•     2.3.1 细胞融合
•     2.3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选
•     2.3.3 杂交瘤细胞的亚克隆
•     2.3.4 杂交瘤细胞的扩大培养
•     2.3.5 杂交瘤细胞的冻存
•     2.3.6 杂交瘤细胞的复苏
•       2.4 单克隆抗体的制备
•     2.4.1 体外培养法
•     2.4.2 体内培养法
•     2.4.3 腹水的纯化
•       2.6 单克隆抗体的鉴定
•     2.6.1 单抗亚类鉴定
•     2.6.2 间接IFA试验
•     2.6.3 单抗特异性鉴定
•     2.6.4 相加ELISA鉴定
•     2.6.5 单抗相对亲和力的测定
•     3 结果
•       3.1 间接ELISA方法的建立
•       3.2 杂交瘤细胞的筛选
•       3.3 杂交瘤细胞株稳定性鉴定
•       3.4 抗体效价测定
•       3.5 单克隆抗体的纯化
•       3.6 单克隆抗体的鉴定
•     3.6.1 单抗亚型鉴定
•     3.6.2 间接IFA鉴定
•     3.6.3 单抗特异性鉴定
•     3.6.4 相加ELISA鉴定
•     3.6.5 相对亲和力的测定
•     4 讨论
•     5 小结
•   第二章 DTMUV抗体检测试剂盒的研制
•     1 材料
•       1.1 血清
•       1.2 主要仪器
•       1.3 主要试剂
•       1.4 溶液配制
•     2 方法
•       2.1 标准血清的制备
•       2.2 酶标抗体的制备
•       2.3 直接阻断ELISA方法的建立和优化
•     2.3.1 最佳抗原包被浓度和酶标单抗工作浓度的确定
•     2.3.2 最佳血清稀释度的确定
•     2.3.3 最佳包被时间的确定
•     2.3.4 BSA浓度及封闭时间的确定
•     2.3.5 温育时间的确定
•     2.3.6 显色时间的确定
•       2.4 试剂盒各组分的制备
•     2.4.1 抗原包被板
•     2.4.2 酶标抗体工作液
•     2.4.3 标准血清
•     2.4.4 样品稀释/洗涤液
•     2.4.5 显色液
•     2.4.6 终止液
•       2.5 试剂盒的组装和质量检测
•     2.5.1 试剂盒的组装
•     2.5.2 试剂盒的临界值
•     2.5.3 重复性试验
•     2.5.4 特异性试验
•     2.5.5 敏感性试验
•     2.5.6 稳定性试验
•     2.5.7 临床样品检测
•     3 结果
•       3.1 阳性血清效价检测
•       3.2 酶标抗体的制备
•       3.3 直接阻断ELISA方法的优化
•     3.3.1 最佳抗原包被浓度和HRP-MAb工作浓度的确定
•     3.3.2 最佳血清稀释度的确定
•     3.3.3 E蛋白包被时间的确定
•     3.3.4 BSA浓度及封闭时间的确定
•     3.3.5 温育时间的确定
•     3.3.6 显色时间的确定
•       3.4 试剂盒各组分的检验
•     3.4.1 无菌检验
•     3.4.2 抗原包被板的检验
•     3.4.3 酶标抗体工作液的检验
•     3.4.4 标准血清的检验
•       3.5 试剂盒的组装
•       3.6 试剂盒临界值的确定
•       3.7 试剂盒的鉴定
•     3.7.1 重复性鉴定
•     3.7.2 特异性鉴定
•     3.7.3 敏感性鉴定
•     3.7.4 稳定性鉴定
•     3.7.5 临床样品检测
•     4 讨论
•     5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邓杰

导师: 贾仁勇,方鹏飞

关键词: 鸭坦布苏病毒,蛋白,单克隆抗体,直接阻断,试剂盒

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000615

总页数: 64

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