黑曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因的调取、克隆和初步表达

论文摘要

α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）是一种糖苷水解酶,它能够特异性水解非还原性末端的鼠李糖基。目前α-L-鼠李糖苷酶广泛地应用于食品、制药、化工等行业,市场前景广阔。微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶一般都需要诱导物的诱导来促进产酶,但同时还伴随有β-葡萄糖苷酶产生,混合酶不仅存在纯化困难的问题还对后续应用造成不便。因此,得到单一并且催化效率高的α-L-鼠李糖苷酶就显得十分必要。本课题组前期分离得到一株黑曲霉菌株NCU-317,在进行诱导产α-L-鼠李糖苷酶的同时也有β-葡萄糖苷酶的产生。因此本研究拟通过现代分子生物学技术构建工程菌的方法来解决上述存在的问题。本论文主要结果如下:1、通过改变文献广泛报道的液体摇瓶为固体平板培养方法,提取到了完整的总RNA,随后采用改进的RACE技术并结合设计了特异性的接头引物,并充分运用了TdT末端转移酶的性质,还运用了Nested PCR、Touch-down PCR来提高RACE技术的稳定性和可靠性。经过实验发现此改良后的RACE法应用于黑曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因调取效果良好。2、以前期得到的黑曲霉NCU-317 cDNA为模板,通过普通PCR成功获得了α-L-鼠李糖苷酶基因（α-L-Rha）全长。α-L-鼠李糖苷酶基因全长3018bp,其中含有2748bp的完整开放阅读框,5’非编码区长为216bp,3’非编码区长为72bp。经过对序列的生物信息学分析显示:编码蛋白由915个氨基酸组成,预测理论分子量为103.94kD,等电点为5.59;蛋白质二级结构以无规则卷曲为主;将氨基酸序列输入UniProt比对后发现,黑曲霉NCU-317的产酶序列与细菌家族中的α-L-鼠李糖苷酶家族蛋白同源性最高,达到了99.6%。3、构建原核重组表达载体pET25b-α-L-Rha,采用能够识别稀有密码子的Rossetta为宿主菌。经过IPTG诱导实验,确定原核表达载体分泌的α-L-鼠李糖苷酶为包涵体形式,包涵体经稀释透析复性法后以芦丁和柚皮苷为底物进行去鼠李糖基活性测定,HPLC法几乎检测不到重组α-L-鼠李糖苷酶活性。4、构建了pPIC9K-α-L-Rha重组载体,毕赤酵母GS115为宿主菌。用Bgl II对重组载体线性化后电转入毕赤酵母GS115,筛选到8株符合Bgl II线性化表型的转化子,分别诱导后,但是几乎测不到有α-L-鼠李糖苷酶酶活出现。随后将8株阳性毕赤酵母工程菌诱导120 h后,对上清专门进行了70%的硫酸铵沉淀和透析操作,最终几乎检测不到酶活。5、随后将黑曲霉NCU-317中原始基因和来源于JMU-TS528的原始产酶序列分别优化后,在优化的JMU-TS528基因工程菌中检测到了酶活,其酶活在45℃达到了626.21 U/mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 α-L-鼠李糖苷酶的研究进展
•     1.1.1 α-L-鼠李糖苷酶简介
•     1.1.2 α-L-鼠李糖苷酶产酶来源
•     1.1.3 不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质比较
•     1.1.4 α-L-鼠李糖苷酶的克隆表达研究
•     1.1.5 α-L鼠李糖苷酶的应用
•   1.2 大肠杆菌表达系统介绍
•     1.2.1 复制子
•     1.2.2 启动子
•     1.2.3 大肠杆菌表达系统特点
•   1.3 毕赤酵母表达系统介绍
•     1.3.1 Pichia pastoris作为宿主菌的基础
•     1.3.2 线性化载体整合Pichia pastoris方式
•     1.3.3 Pichia pastoris表达系统优缺点
•   1.4 研究内容及选题意义
•     1.4.1 研究内容
•     1.4.2 选题意义
• 第2章 黑曲霉NCU-317中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆及生物信息学分析
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 实验用试剂和溶液配置
•     2.1.5 黑曲霉NCU-317 的活化和固体培养
•     2.1.6 黑曲霉NCU-317总RNA提取
•     2.1.7 黑曲霉NCU-317的α-L鼠李糖苷酶基因调取及转化
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 黑曲霉NCU-317 的总RNA提取
•     2.2.2 黑曲霉NCU-317中α-L鼠李糖苷酶5’端基因
•     2.2.3 黑曲霉NCU-317中α-L鼠李糖苷酶3’端基因
•     2.2.4 黑曲霉NCU-317中α-L鼠李糖苷酶CDS序列扩增
•     2.2.5 黑曲霉NCU-317中α-L鼠李糖苷酶基因序列分析
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
•     2.4.1 改变黑曲霉培养方式
•     2.4.2 改良RACE技术调取产酶基因序列
• 第3章 黑曲霉NCU-317中α-L鼠李糖苷酶基因原核表达研究
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 实验试剂
•     3.1.3 实验仪器
•     3.1.4 实验用试剂和溶液配置
•     3.1.5 pET25b-α-L-Rha原核重组表达载体构建
•     3.1.6 α-L-鼠李糖苷酶在大肠杆菌Rossetta中的原核表达
•     3.1.7 包涵体的变性,复性和酶活测定
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 pET25b-α-L-Rha原核重组表达载体构建与鉴定
•     3.2.2 大肠杆菌Rossetta中 α-L-Rha基因的原核表达探究
•     3.2.3 包涵体变性与复性
•     3.2.4 酶活测定
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第4章 黑曲霉中α-L鼠李糖苷酶基因真核表达研究
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 实验试剂
•     4.1.3 实验仪器
•     4.1.4 实验用试剂和溶液配置
•     4.1.5 pPIC9K-α-L-Rha真核重组表达载体构建
•     4.1.6 毕赤酵母GS115 感受态制备
•     4.1.7 pPIC9K-α-L-Rha真核表达载体的转化
•     4.1.8 GS115 工程菌中α-L-鼠李糖苷酶的表达探究
•     4.1.9 重组蛋白酶活测定
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 pPIC9K-α-L-Rha重组表达载体构建
•     4.2.2 阳性毕赤酵母GS115 表型筛选和鉴定
•     4.2.3 毕赤酵母阳性转化子多拷贝筛选
•     4.2.4 毕赤酵母GS115中α-L-Rha基因的真核表达
•     4.2.5 HPLC法测定重组酶酶活
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第5章 黑曲霉中α-L鼠李糖苷酶基因密码子优化后真核表达研究
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 菌株和质粒
•     5.1.2 实验试剂
•     5.1.3 实验仪器
•     5.1.4 实验用试剂和溶液配置
•     5.1.5 重组表达载体转化
•     5.1.6 GS115 工程菌中密码子优化后α-L-鼠李糖苷酶的表达
•     5.1.7 重组蛋白酶活测定
•   5.2 实验结果
•     5.2.1 优化基因后的重组表达载体鉴定
•     5.2.2 阳性毕赤酵母GS115 鉴定
•     5.2.3 毕赤酵母GS115 中优化α-L-Rha基因的真核表达
•     5.2.4 HPLC法测定重组酶酶活
•   5.3 讨论
•   5.4 小结
• 第6章 结论与展望
•   6.1 研究结果与结论
•   6.2 进一步工作方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董德源

导师: 陆豫,余勃

关键词: 黑曲霉,鼠李糖苷酶,生物信息学分析,克隆表达

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q933

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.001676

总页数: 100

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