影响单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型复制的宿主基因的筛选

论文摘要

研究背景及意义:单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型是引起多种疾病的重要病原,通常这些疾病具有反复发作和无法根治的特点。单纯疱疹病毒在人类群体中的感染率高居不下,很大程度上是因为其具有潜伏感染这一特征性质。当病毒所潜伏的细胞内分子生物学环境发生特定改变时,就会重新激活病毒的增殖,从而造成疾病的复发。在HSV的潜伏与激活的复杂机制中,有许多关键的因子在其中发挥着作用,包括来自HSV的LATs,miRNA和其自身表达的蛋白,也有来自宿主的影响因子,包括神经元抑制因子、表观遗传调控和免疫系统控制等。本课题组发现了 一种神经元特异性高表达的microRNA,即miR-138,它能够通过靶向抑制HSV-1的即刻早期基因ICPO表达,从而发挥抑制HSV-1复制的作用。我们在后续的研究中发现,miR-138还可以通过不依赖于靶向ICPO的作用而抑制HSV-1的复制,同时使用PAR-CLIP与RNAseq相结合的方法发现,miR-138在HSV-1仅有ICPO一个有效靶向位点。这预示着miR-138还可以通过非病毒途径即宿主途径发挥着促进病毒潜伏的作用。基于该基本假设,我们开展了对miR-138靶向宿主基因的研究。同时,基于实验室已经发现的HSV-1潜伏于小鼠神经元时一些高表达的宿主基因,筛选出在HSV潜伏的时期可以发挥关键作用的候选基因。方法:基于实验室已经获取的能与miR-138结合的宿主基因信息。我们利用这些基因特异性的siRNA,去敲降这些基因的表达,从而观察这些基因的下调是否会引起病毒病毒复制水平降低。同时,我们构建这些基因的过表达载体,观察这些基因的蛋白在过表达状态下是否会同时对病毒的水平起到促进作用。通过这两个角度,我们筛选出对病毒复制水平影响较大的基因,作为miR-138靶向宿主基因通路调控病毒潜伏的关键候选基因。再通过双荧光素酶报告基因分析和western blot实验进一步确定miR-138对这些基因是否具有真正的靶向作用。接着我们利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除了细胞系中筛选出来的候选基因,以验证在候选基因在缺失的状态下,miR-138是否可以宿主通路影响病毒的复制水平。最后,我们还利用基因功能获得的方式筛选出在HSV潜伏的时期可以发挥关键作用的候选基因。结果:我们利用siRNA敲降基因表达水平以后观察其对HSV-1复制的影响,发现对 Ccdc6,Daam2,Mllt6,Nfyc,Arid1a,Oct-1,Foxc1 基因的敲降,会对HSV-1复制水平抑制作用超过一倍,我们又将宿主基因在细胞系中过表达,仅发现Oct-1和Foxc1在Neuro-2A细胞中对病毒复制水平有促进作用,其中Foxc1的促进作用约12倍。随后,双荧光素酶报告基因分析和western blot实验结果显示,miR-138在Oct-1基因CDS区域和Foxc1基因3’UTR区域均有两个miR-138作用位点,且能抑制蛋白表达。并且在Foxc1敲除的Neuro-2A细胞系中,miR-138对HSV-1的复制水平的抑制表现出了很强的功能缺失。我们利用过表达实验发现,Egr1和Gprc5a两个宿主基因对病毒复制水平有很强的抑制作用。结论:在miR-138促进HSV-1潜伏的机制研究中,Foxc1和Oct-1在宿主促进潜伏的通路上起着关键,其中Foxc1基因起主导作用。Egr1和Gprc5a基因对HSV的复制起到抑制作用,可以作为促进HSV潜伏的候选宿主基因。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 宿主miR-138通过调节宿主基因表达促进单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验方法
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 筛选基因表达被抑制时对病毒复制水平起抑制作用的宿主基因
•     2.2.2 筛选在基因过表达时对病毒复制起促进作用的宿主基因
•     2.2.3 深入验证miR-138靶向Foxc1和Oct-1进而影响病毒复制水平
•     2.2.4 miR-138在Foxc1敲除的Neuro-2A细胞中减弱了对病毒的抑制作用
• 3 miR-138对单纯疱疹病毒Ⅱ型ICPO 3'UTR的靶向作用及保守性分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验方法
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 miR-138在单纯疱疹病毒Ⅱ型ICPO 3'UTR存在一个靶位点
•     3.2.2 miR-138对单纯疱疹病毒Ⅱ型ICPO 3'UTR的靶向作用具有高度保守性
•     3.2.3 应用CRISPR/Cas9系统未能对单纯疱疹病毒Ⅱ型ICPO 3'UTR miR-138靶位点进行有效突变
•     3.2.4 应用CRISPR/Cas9系统在单纯疱疹病毒Ⅱ型中插入绿色荧光蛋白
• 4 在HSV-1潜伏感染的小鼠神经元的高表达宿主基因中筛选影响病毒复制的基因
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验方法
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 Gprc5a和Egr1在过表达情况下对单纯疱疹病毒有抑制作用
• 5 讨论与结论
• 综述 单纯疱疹病毒潜伏与激活机制的研究进展
•   引言
•   1 单纯疱疹病毒潜伏感染的建立
•     1.1 抑制裂解基因的表达
•     1.2 病毒裂解基因的染色质沉默
•     1.3 免疫系统的控制
•   2 单纯疱疹病毒激活机制
•     2.1 转录延伸因子与HSV激活的过程
•     2.2 染色质激活与HSV激活的过程
•     2.3 LAT基因与HSV激活的过程
•     2.4 HSV激活与细胞凋亡
•   3 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间主要简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙博强

导师: 潘冬立

关键词: 单纯疱疹病毒型,宿主基因,潜伏

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 浙江大学

分类号: R373.11

DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001245

总页数: 78

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