基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立

论文摘要

旨在建立一种准确且快速的基于瞬时表达系统的水稻mi RNA靶基因验证系统,为研究水稻miRNAs的生物学功能奠定基础。已有研究证实osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4（LOCOs03g48970.1）的mRNA,以此为参照,在烟草和水稻原生质体瞬时表达系统中将miR169o前体基因分别与LUC表达载体、LUC-48970和LUC-48970m3融合表达载体瞬时共表达,通过CCD活体成像和Luminometor分析了共表达后LUC活性的动态变化。利用茎环qRT-PCR对miR169o的表达水平进行分析,获得靶基因验证的适合体系。在水稻原生质体体系中,LUC活性和miR169o表达水平在原生质体转化后逐渐增高;24 h时LUC活性最高,相应miR169o表达水平上升10倍左右。综合分析,在原生质体转化后24 h-36 h为适宜检测时间段。在烟草瞬时表达体系中,农杆菌注射72 h后LUC活性最强,而miR169o的表达在48 h后即可上调20倍。因此,农杆菌注射后48 h-72 h为适宜检测时间段。本系统为水稻miRNA靶基因的验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内真实情况的实验方法。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 水稻原生质体的制备
•     1.2.2 原生质体转化
•     1.2.3 原生质体总RNA的提取
•     1.2.4 cDNA的反转录及实时荧光定量PCR
•     1.2.5 LUC活性的检测
•     1.2.6 农杆菌介导的烟草瞬时表达[18]
• 2 结果
•   2.1 相关载体的构建
•     2.1.1 miR169o过表达载体的构建
•     2.1.2 pUC19-LUC和p CAMBIA1300-LUC载体的构建
•     2.1.3 LUC-靶基因融合表达载体的构建
•   2.2 水稻原生质体系统的靶基因验证体系
•   2.3 烟草瞬时表达系统的靶基因验证体系
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 胡积祥,曹雅倩,朱秀梅,余超,田芳,杨凤环,陈华民,何晨阳

关键词: 水稻,荧光素酶,靶基因验证,瞬时表达系统

来源: 生物技术通报 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农作物

单位: 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

基金: 国家转基因新品种培育重大专项（2016ZX08001-002）,国家重点研发计划（2017YFD0200900）,国家自然科学基金面上项目（30970310）

分类号: Q943.2;S511

DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0175

页码: 57-63

总页数: 7

文件大小: 4067K

下载量: 197