黄河入海口微生物驱动的氮循环过程及其影响因素的研究

论文摘要

黄河入海口地处黄河、渤海与莱州湾的交汇处,是我国三大河口之一。根据《中国海洋环境状况公报》数据显示,近年来氮素成为黄河汇入海洋的主要污染物之一。氮素过量排放导致黄河入海口及毗邻海域富营养化程度加重,局部生态系统遭到严重破坏。因此,研究和解决氮素过量引起的黄河入海口生态问题已成为一个严峻而紧迫的课题。微生物参与地球元素物质循环,在河口区氮素削减过程中发挥着重要作用。微生物驱动的氮循环主要包括硝化、反硝化、硝酸盐异化还原成铵和厌氧氨氧化等过程。其中氨氧化过程是硝化过程的限速步骤,可将环境中的铵态氮转化为亚硝态氮,是硝化-反硝化联合脱氮的第一步;反硝化、厌氧氨氧化及硝酸盐异化还原成铵过程可将环境的硝态氮进行还原和转化,从而实现氮素的削减。目前,对于驱动黄河入海口氮素转化过程的主要微生物类群及影响因素尚不清楚。本论文选取黄河入海口为研究区域,综合利用同位素示踪、高通量测序、功能基因克隆文库和定量PCR等方法,首先探寻了黄河入海口氨氧化微生物的丰度、多样性及群落分布特征;进一步研究了黄河入海口微生物驱动的硝酸盐还原过程及其影响因素;最后通过微宇宙实验探寻了关键因素（硝酸盐）对微生物驱动的硝酸盐还原速率及细菌群落结构的影响规律。主要研究结果如下:（1）黄河入海口生境可检测到丰富的氨氧化微生物类群,其丰度及群落组成在水体和沉积物两个生境中存在差异。功能基因定量PCR检测结果表明,无论在水体还是沉积物生境,氨氧化古菌（Ammonia oxidizing bacteria,AOA）amoA基因的丰度均显著高于氨氧化细菌（Ammonia oxidizing archaea,AOB）。功能基因克隆文库结果表明,在海水样品中AOB较之AOA呈现出相对较高的Chao1丰富度指数和香农多样性指数,而沉积物样品的多样性指数没有明显的分布规律。通过系统发育分析,所有的AOA序列可划分为Nitrososphaera,Nitrosopumilus和Nitrosotalea属,其中Nitrososphaera属的相对丰度在多数沉积物样品中占优势,而Nitrosopumilus和Nitrosotalea属在水体样品中占优势,说明AOA类群存在生境分布差异。AOB的所有序列划分为Nitrosospira和Nitrosomonas属,其中Nitrosospira属的相对丰度在两个生境中均占优势,说明主要AOB类群并没有表现出明显的生境分布差异。主坐标分析同样表明AOA群落结构在水体和沉积物样品间呈现显著差异,而AOB群落差异不显著。微生物群落与理化参数的相关性分析表明,总碳和总有机碳含量是影响沉积物生境中氨氧化微生物丰度和群落组成的关键因素,而本实验所测理化因子含量对水体中的氨氧化群落没有显著影响。（2）反硝化是黄河入海口湿地主要的硝酸盐还原过程,硝酸盐含量是影响硝酸盐还原过程的关键因素。利用15N同位素示踪实验的结果证明,黄河入海口湿地可检测到三类微生物（反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐异化还原成铵）驱动的硝酸盐还原速率,其中反硝化速率对大多数样品中（所有夏季样品及77%的冬季样品）的硝酸盐还原贡献率超过一半,表明反硝化微生物是河口湿地生境中参与硝酸盐还原的主要类群。差异分析表明,厌氧氨氧化速率在冬季显著高于夏季,而反硝化及硝酸盐异化还原成铵速率并不随季节产生显著变化。定量PCR结合线性拟合分析表明,厌氧氨氧化16S rRNA基因丰度与其速率存在显著正相关关系,且在冬季相关性要明显高于夏季;硝酸盐异化还原成铵nrfA基因丰度仅在夏季表现出与速率显著相关;而反硝化功能基因（nirK和nirS）的丰度与速率间并无显著相关关系。相关性分析结果表明,反硝化和硝酸盐异化还原成铵的速率与硝酸盐含量呈显著正相关关系;厌氧氨氧化速率仅表现出与温度呈显著负相关关系;硝酸盐含量是影响细菌16S rRNA基因及硝酸盐异化还原成铵nrfA基因丰度的关键因子。（3）硝酸盐浓度的增加可提高反硝化速率,降低厌氧氨氧化及硝酸盐异化还原成铵速率,并影响细菌的丰度、多样性及群落组成。15N同位素示踪实验表明,反硝化速率随硝酸盐浓度的增加而升高,而厌氧氨氧化及硝酸盐异化还原成铵的速率随硝酸盐浓度的增加呈降低趋势。定量PCR检测结果表明,细菌16S rRNA基因及硝酸盐还原功能基因的丰度均随着硝酸盐浓度的增加而降低。线性拟合分析表明,厌氧氨氧化16S rRNA基因和硝酸异化还原成铵nrfA基因的丰度与其对应速率显著正相关。高通量测序结果表明,细菌群落的香农多样性指数和均匀度指数在硝酸盐浓度为400和600μM的样品中显著低于其他样品,在600μM的样品中最低。细菌群落组成在硝酸盐浓度为400和600μM的样品中与其余样品中呈显著差异。γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）在所有的样品中均为优势类群,其在样品中的相对丰度随着硝酸盐浓度的增加而升高。通过多元回归树结合多样性分析,可将样品按硝酸盐浓度划分为低浓度组（0和100μM）与高浓度组（400和600μM）。网络共存分析表明,两组样品间的细菌群落共存网络呈现较大差异,高浓度硝酸盐组具有更复杂的网络结构。线性判别效应分析表明,γ变形菌纲和芽孢杆菌纲（Bacilli）等为高浓度组的指示细菌类群。本论文对黄河入海口区域微生物驱动的氮循环过程及其影响因素进行了研究。结果表明,氨氧化古菌是黄河入海口主要的氨氧化微生物类群,且氨氧化微生物的丰度及群落组成在水体和沉积物两个生境中存在差异;反硝化是黄河入海口湿地主要的硝酸盐还原过程,硝酸盐含量是影响硝酸盐还原过程的关键因素;硝酸盐浓度变化可影响微生物驱动的硝酸盐还原速率及细菌丰度、群落组成。研究结果可以深化对黄河入海口微生物驱动的氮元素生物地球化学循环的认识,还可为河口生态保护、氮素污染承载与控制提供重要科学依据。

论文目录

• 缩略词说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 河口及海洋环境微生物及其主要生态功能概述
•     1.1.1 河口及海洋环境微生物生态学简述
•     1.1.2 河口及海洋环境微生物主要生态功能概述
•   1.2 河口及海洋环境微生物驱动的氮循环过程
•     1.2.1 固氮过程
•     1.2.2 硝化过程
•     1.2.3 反硝化过程
•     1.2.4 厌氧氨氧化过程
•     1.2.5 硝酸盐异化还原成铵过程
• 15N同位素的氮素迁移研究'>  1.3 河口及海洋环境基于¹⁵N同位素的氮素迁移研究
•   1.4 河口及海洋环境基于测序方法的微生物分子生态学研究
•     1.4.1 基于传统测序方法的微生物分子生态学研究
•     1.4.2 基于高通量测序方法的微生物分子生态学研究
•   1.5 研究区域概况及主要生态问题
•     1.5.1 黄河入海口水体与沉积物生态系统
•     1.5.2 黄河入海口湿地生态系统
•   1.6 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验所用样品材料
•     2.1.2 菌株和质粒
•     2.1.3 主要酶及生化试剂
•     2.1.4 实验相关引物
•   2.2 方法
•     2.2.1 采样区域概述及样品采集
•       2.2.1.1 黄河入海口水体及沉积物采样点描述及样品采集
•       2.2.1.2 黄河入海口湿地及滩涂采样点描述及样品采集
•       2.2.1.3 微宇宙实验的设计及样品采集
•     2.2.2 样品理化指标测定
•     2.2.3 微生物潜在硝酸盐还原速率测定及计算
•       2.2.3.1 反硝化及厌氧氨氧化速率测定及计算
•       2.2.3.2 硝酸盐异化还原成铵速率测定及计算
•     2.2.4 样品核酸提取与检测
•       2.2.4.1 湿地及沉积物土壤样品DNA提取与检测
•       2.2.4.2 水体样品DNA提取与检测
•       2.2.4.3 湿地及沉积物土壤样品RNA提取与检测
•       2.2.4.4 水体样品RNA提取与检测
•     2.2.5 目的基因的标准质粒模板构建
•       2.2.5.1 目的基因的PCR扩增
•       2.2.5.2 目的基因PCR产物的回收纯化
•       2.2.5.3 目的基因与克隆载体的连接
•       2.2.5.4 克隆载体的大肠杆菌感受态细胞转化
•       2.2.5.5 阳性克隆的筛选
•       2.2.5.6 标准质粒的获得
•     2.2.6 荧光定量PCR检测目的基因丰度
•     2.2.7 克隆文库的构建
•     2.2.8 系统发育树的构建
•     2.2.9 高通量测序上机处理
•     2.2.10 高通量数据下机分析
•     2.2.11 统计学分析及数据可视化
• 3 结果与分析
•   3.1 黄河入海口水体及沉积物中氨氧化微生物的群落特征及其影响因素研究
•     3.1.1 水体及沉积物样品基本理化特征
•     3.1.2 氨氧化微生物的丰度
•     3.1.3 氨氧化微生物的多样性
•       3.1.3.1 氨氧化微生物的α-多样性
•       3.1.3.2 氨氧化微生物的β-多样性
•     3.1.4 氨氧化微生物的系统进化树
•       3.1.4.1 氨氧化古菌amoA基因的系统进化树
•       3.1.4.2 氨氧化细菌amoA基因的系统进化树
•     3.1.5 氨氧化微生物的群落聚类
•     3.1.6 氨氧化微生物与理化参数的相关性
•       3.1.6.1 氨氧化微生物丰度、多样性及优势物种与理化参数的相关性
•       3.1.6.2 氨氧化微生物群落结构与理化参数的相关性
•   3.2 黄河入海口湿地微生物驱动的硝酸盐还原过程及其影响因素研究
•     3.2.1 湿地土壤基本理化特征
•     3.2.2 微生物驱动的硝酸盐还原速率分布特征
•     3.2.3 微生物驱动的硝酸盐还原速率与理化参数的相关性
•     3.2.4 细菌16S rRNA基因及硝酸盐还原功能基因的丰度
•     3.2.5 硝酸盐还原功能基因丰度与其对应速率的线性拟合
•     3.2.6 细菌16S rRNA基因及硝酸盐还原功能基因的丰度与理化参数的相关性
•   3.3 硝酸盐处理对微生物驱动的硝酸盐还原速率及细菌群落分布特征的影响研究
•     3.3.1 硝酸盐处理样品中微生物驱动的硝酸盐还原速率
•     3.3.2 硝酸盐处理样品中细菌16S rRNA基因及功能基因的丰度
•     3.3.3 硝酸盐处理样品的硝酸盐还原功能基因丰度与其对应速率的线性拟合
•     3.3.4 硝酸盐处理样品的高通量测序及稀释曲线
•     3.3.5 硝酸盐处理样品中细菌群落多样性
•       3.3.5.1 硝酸盐处理样品中细菌群落的α-多样性
•       3.3.5.2 硝酸盐处理样品中细菌群落的β-多样性
•     3.3.6 硝酸盐处理样品中的优势细菌类群
•     3.3.7 硝酸盐处理与细菌群落的多元回归树分析
•     3.3.8 不同硝酸盐处理组细菌群落的网络共存关系
•     3.3.9 不同硝酸盐处理组中细菌指示类群
• 4 讨论
•   4.1 黄河入海口氨氧化古菌是优势的氨氧化微生物类群
•   4.2 黄河入海口氨氧化微生物存在生境分布差异
•   4.3 黄河入海口氨氧化微生物分布特征受碳含量影响
•   4.4 黄河入海口反硝化过程是主要的硝酸盐还原过程
•   4.5 黄河入海口硝酸盐还原过程的速率和丰度受多种环境因子共同影响
•   4.6 硝酸盐是影响微生物驱动的硝酸盐还原速率的关键因子
•   4.7 硝酸盐浓度影响细菌的群落组成
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文及成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李明聪

导师: 王晓云,高峥

关键词: 黄河入海口,氮循环,硝酸盐还原速率,丰度,微生物群落结构

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,海洋学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 山东农业大学

分类号: X55;X172

总页数: 111

文件大小: 6124K

下载量: 639