Nyap1在小鼠大脑皮层发育中的作用及机制研究

论文摘要

哺乳动物大脑皮质经过正常发育最终会形成致密的六层结构,该结构对大脑皮质行使正常的生理功能十分重要。大脑皮质发育异常可能导致:癫痫,认知功能障碍,小脑症和巨脑症等重大神经系统疾病发生的可能。大脑皮质的发育需要经过神经祖细胞增殖,神经元迁移,分化,建立突触联系等多项步骤协调进行。其中,神经元迁移是大脑皮层六层结构形成的基础,新出生的神经元越过原来产生的神经元到达皮质外层,依次形成“由内而外”的层状结构。PI3-激酶神经元酪氨酸磷酸化接头蛋白1（neuronal tYrosine-phosphorylated adaptor for PI3-kinase 1,Nyap1）是NYAP家族（NYAPs）中的一员,该家族还包括Nyap2和Nyap3。NYAPs有一段同源区域具有保守的酪氨酸残基和一段脯氨酸富集区域。NYAPs是大脑中主要的磷蛋白,在与PI3K相关的酪氨酸磷酸化作用中,NYAPs占据其中的四分之三。NYAPs在小鼠大脑皮质中高度表达,并且NYAPs还介导细胞中actin细胞骨架重塑。敲除NYAPs会使神经元突起生长不足,大脑皮质变薄,其中Nyap1的敲除表现得最为明显。Nyap1在整个大脑皮质中都有表达,且从E10开始在围产期前后达到峰值,表明Nyap1在皮质发育中起到重要作用,但对于Nyap1在神经元迁移中的研究还鲜有报道。本研究以小鼠大脑皮质为研究对象,通过构建Nyap1的超表达载体（Nyap1）,干扰载体（shNyap1）,酪氨酸点突变载体(Nyap1Y212F、Nyap1Y257F和Nyap1Y212/257F),运用子宫内电击转染、细胞转染、Western Blot、免疫荧光染色和激光共聚焦拍照等方法,研究分析Nyap1在神经元迁移过程中作用及其机制。此外,通过构建Fyn的干扰载体（shFyn）、酪氨酸激活载体（Fyn-CA）研究Nyap1与Fyn在神经元迁移过程中二者之间的分子机制。主要结果包括:1.成功克隆Nyap1基因片段并构建Nyap1的超表达载体,运用细胞转染技术转染3T3细胞,确定超表达载体成功表达;利用子宫内电击转染技术,标记神经细胞,发现Nyap1促进神经元突起伸长和突起分支,通过在不同时间点取材,确定Nyap1促进神经元从中间带（intermediate zone,IZ）向皮质板（cortical plate,CP）的迁移。2.成功构建Nyap1的干扰载体,对NIH3T3细胞转染验证,确定质粒成功表达;使用HEK293T细胞转染,Western Blot检测干扰效率;子宫内电击转染shNyap1质粒,观察到神经元迁移受到抑制。主要表现在大部分神经元聚集于IZ（中间带）区,并保持多极形态,多极向双极转换受到抑制。3.利用定点突变技术,成功构建Nyap1的酪氨酸点突变载体(Nyap1Y212F、Nyap1Y257F和Nyap1Y212/257F),使用3T3细胞转染质粒,确定质粒成功表达;子宫内电击转染Nyap1Y212F和Nyap1Y257F发现,神经元促进迁移的水平减弱,介于Nyap1和GFP之间;神经元的形态基本恢复正常;转染Nyap1Y212/257F后,神经元迁移受到抑制,在E18.5天,大量神经元仍停留在IZ（中间带）区;CP（皮质板）区神经元形态基本恢复正常,IZ-CP（中间带-皮质板）边界有的神经元出现了两个突起,说明Nyap1酪氨酸磷酸化缺失影响神经元正常迁移和形态。4.通过共转shFyn和Nyap1,发现神经元迁移障碍得到挽救;共转Fyn-CA和shNyap1并不能挽救神经元迁移障碍;共转shFyn和Nyap1Y212/257F并不能完全挽救神经元迁移障碍。以上结果说明,Nyap1是Fyn的下游分子之一,Fyn可以通过磷酸化Nyap1发挥作用。综上所述,Nyap1的酪氨酸磷酸化作用是调控神经元迁移的关键,并且Fyn可以通过磷酸化Nyap1调控神经元迁移。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 小鼠大脑皮质结构及神经元迁移
•   1.1 小鼠大脑皮层结构
•   1.2 神经元迁移概述
•     1.2.1 神经元迁移种类及过程
•     1.2.2 神经元多极-双极转换
•   1.3 细胞骨架与神经元迁移
•   1.4 神经元迁移相关信号通路
• 第二章 NYAP结构及功能
•   2.1 NYAPs的结构与表达模式
•   2.2 NYAP介导的信号通路
•   2.3 NYAP介导Actin细胞骨架重塑
•   2.4 NYAP与脑部发育
• 第三章 过表达Nyap1 对神经元形态及迁移的影响
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 材料与试剂
•     3.1.3 Nyap1 表达载体的构建
•     3.1.4 细胞培养及转染
•     3.1.5 细胞免疫荧光染色及拍照分析
•     3.1.6 子宫内电击转染
•     3.1.7 组织取材与切片制备
•     3.1.8 组织免疫荧光染色及显微镜拍照
•     3.1.9 统计分析
•   3.2 结果
•     3.2.1 pCAG-Nyap1-EGFP真核表达载体的构建
•     3.2.2 Nyap1 在真核细胞中成功表达
•     3.2.3 Nyap1 对神经元形态的影响
•     3.2.4 Nyap1 对神经元迁移的影响
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第四章 干扰Nyap1 对神经元形态及迁移的影响
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 材料与试剂
•     4.1.3 Nyap1 干扰载体构建
•     4.1.4 Nyap1-R表达载体构建
•     4.1.5 细胞培养及转染
•     4.1.6 细胞免疫荧光染色及拍照分析
•     4.1.7 蛋白样品提取
•     4.1.8 Western Blot
•     4.1.9 子宫内电击转染
•     4.1.10 组织取材与切片制备
•     4.1.11 组织免疫荧光染色及显微镜拍照
•     4.1.12 统计分析
•   4.2 结果
•     4.2.1 表达载体的构建
•     4.2.2 干扰表达载体在真核细胞中的表达
•     4.2.3 shNyap1 敲降效果检测
•     4.2.4 抑制Nyap1 对神经元迁移的影响
•     4.2.5 抑制Nyap1 对神经元形态的影响
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第五章 Nyap1 磷酸化水平对神经元形态及迁移的影响
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验动物
•     5.1.2 材料与试剂
•     5.1.3 Nyap1 突变表达载体的构建
•     5.1.4 细胞培养及转染
•     5.1.5 细胞免疫荧光染色及拍照分析
•     5.1.6 子宫内电击转染
•     5.1.7 组织取材与切片制备
•     5.1.8 组织免疫荧光染色及显微镜拍照
•     5.1.9 统计分析
•   5.2 结果
•     5.2.1 Nyap1 磷酸化突变体真核表达载体的构建
•     5.2.2 Nyap1 磷酸化突变载体在真核细胞中成功表达
•     5.2.3 Nyap1 磷酸化位点突变对神经元迁移的影响
•     5.2.4 Nyap1 磷酸化位点突变对神经元形态的影响
•     5.2.5 Nyap1 磷酸化完全缺失对神经元迁移的影响
•     5.2.6 Nyap1 磷酸化完全缺失对神经元形态的影响
•   5.3 讨论
•   5.4 小结
• 第六章 Fyn磷酸化Nyap1 调控神经元迁移
•   6.1 材料与方法
•     6.1.1 实验动物
•     6.1.2 材料与试剂
•     6.1.3 真核表达载体构建
•     6.1.4 子宫内电击转染
•     6.1.5 组织取材与切片制备
•     6.1.6 组织免疫荧光染色及显微镜拍照
•     6.1.7 统计分析
•   6.2 结果
•     6.2.1 超表达Nyap1 挽救shFyn导致的多极-双极转换障碍
•     6.2.2 shNyap1 无法完全挽救Fyn-CA引起的神经元迁移障碍
•     6.2.3 Nyap1 磷酸化缺失无法挽救shFyn导致的多极-双极转换障碍
•   6.3 讨论
•   6.4 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王树中

导师: 赵善廷,朱晓岩

关键词: 酪氨酸磷酸化,神经元迁移

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然基金面上项目(编号:31572477)

分类号: Q42

总页数: 87

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