导读:本文包含了外胚间充质干细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:干细胞,受体,因子,神经,营养,抗原,矿化。
外胚间充质干细胞论文文献综述
杨琨,李骏,丰奇昊,沈梦杰,陈谦谦[1]（2018）在《大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞中p75NTR时钟节律性表达》一文中研究指出目的研究p75神经营养因子受体(p75NTR)、神经生长因子(NGF)及相关时钟节律基因clock、per1、per2、Bmal1在24 h内的表达情况。方法取SD大鼠孕18.5 d胎鼠牙胚组织,采用组织块法培养牙胚来源外胚间充质干细胞(EMSCs)。流式细胞仪进行EMSCs表面分子鉴定CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR,流式细胞仪分选出p75NTR阳性的EMSCs。取分选后的第3代进行实验,血清休克试验进行细胞时钟节律性的诱发,在诱发后的0、4、8、12、16、20、24 h进行细胞收集,提取RNA;RealTime-PCR检测p75NTR、NGF、clock、per1、per2、Bmal1在24 h内不同时间点的表达量。结果组织块法成功培养出牙胚来源的EMSCs,经流式细胞仪检测细胞阳性表达CD14(93.58%)、CD29(95.16%)、CD44(98.66%)、CD90(92.72%)、CD105(28.50%)、CD146(95.21%)、CD166(97.23%)和p75NTR(90.18%),阴性表达CD45(0.43%);流式细胞仪成功分选p75NTR阳性EMSCs,细胞形态呈更为均一的间充质干细胞形态;RealTime-PCR检测p75NTR、NGF、clock、per1、per2、Bmal1不同时间点的表达量,呈现出一定的时钟节律性。结论 p75NTR与NGF及相关时钟基因在牙胚来源的EMSCs中呈节律性表达,p75NTR有可能成为时间生物学在牙齿领域研究进展中的关键性生物节律调控基因。(本文来源于《现代医药卫生》期刊2018年20期）
杨琨,李骏,丰奇昊,沈梦杰,陈谦谦[2]（2018）在《MAGE-D1对大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞增殖迁移能力的影响》一文中研究指出目的研究黑色素瘤相关抗原D1(Melanoma associated antigens,MAGE-D1)对大鼠牙胚来源的外胚间充质干细胞(Ectomensenchymal stem cells,EMSCs)增殖及迁移能力的影响。方法取SD大鼠孕19. 5 d胎鼠牙胚组织,组织块法培养牙胚来源外胚间充质干细胞,流式细胞仪进行外胚间充质干细胞表面分子鉴定CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR,MAGE-D1 siRNA转染入外胚间充质干细胞,实验组分为:对照组(Control)和MAGE-D1 siRNA组(MAGEsiRNA-EMSCs),CCK8法和划痕法分别检测两组细胞增殖能力与迁移能力,Real Time-PCR及Western blot检测迁移及WNT通路相关基因MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin的mRNA及蛋白表达量。结果组织块法成功培养出牙胚来源的外胚间充质干细胞,经流式细胞仪检测细胞阳性表达CD14(92. 16%)、CD29(94. 53%)、CD44(99. 51%)、CD90(95. 18%)、CD105(34. 22%)、CD146(92. 39%)、CD166(98. 15%)和p75NTR(88. 56%),阴性表达CD45(0. 5%);CCK8法检测MAGE-D1 siRNA组EMSCs增殖能力受到抑制;划痕试验法检测MAGE-D1 siRNA组细胞48 h迁移量高于对照组细胞;Real Time-PCR检测Mage-D1、β-catenin和E-cadherin表达量,MAGE-D1 siRNA组EMSCs MAGE-D1和E-cadherin表达较对照组低,而β-catenin表达较高,Western blot检测MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin表达水平趋势与Real Time-PCR结果相一致。结论抑制EMSCs中MAGE-D1的表达上调β-catenin,下调E-cadherin,能够提高细胞的迁移能力,但是其导致增殖能力降低,MAGE-D1可能作为EMSCs迁移增殖能力的关键因子。(本文来源于《遵义医学院学报》期刊2018年05期）
史文涛,戴瑶,陈平波,毕士奇,吕德明[3]（2018）在《鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥材料的体外相容性》一文中研究指出背景:利用磷酸钙骨水泥载间充质干细胞治疗骨缺损已取得令人满意的成果,但是鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞与磷酸钙骨水泥的体外相容性尚不清楚。目的:探讨磷酸钙骨水泥对大鼠鼻黏膜来源外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,进一步探讨鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥的生物相容性。方法:体外培养扩增鼻黏膜来源外胚间充质干细胞,并将其种植于磷酸钙骨水泥表面和培养板(对照组),均进行成骨诱导14 d。碱性磷酸酶活性法检测鼻黏膜来源外胚间充质干细胞的碱性磷酸酶活性,茜素红染色法测定钙结节面积大小,免疫荧光和免疫印迹法检测成骨诱导相关蛋白表达水平;鬼笔环肽染色法动态观察磷酸钙骨水泥表面的细胞形态;MTT法检测磷酸钙骨水泥对细胞增殖的影响。结果与结论:(1)成骨诱导14 d后,磷酸钙骨水泥表面的鼻黏膜来源外胚间充质干细胞碱性磷酸酶活性较高,形成的钙结节较大,骨相关蛋白表达水平较高;(2)磷酸钙骨水泥对鼻黏膜来源外胚间充质干细胞的增殖有一定的促进作用;(3)结果表明,鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥支架材料具有良好的生物相容性,磷酸钙骨水泥对鼻黏膜来源外胚间充质干细胞向成骨细胞分化表现出一定的促进作用。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2018年33期）
肖勇,李刚,王莹莹,赵茜,杨苹珠[4]（2018）在《p75NTR在大鼠外胚间充质干细胞不同融合状态中的表达差异与矿化相关性研究》一文中研究指出目的探讨不同融合状态对p75 neurotrophin receptor(p75 NTR)在外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)中的表达影响。方法用酶消化法获取SD大鼠胚胎12.5 d(E12.5d)EMSCs,以不同细胞密度铺板,贴壁后即获得4种融合状态:半融合状态(1.0×10~4/cm~2)、融合前状态(1.5×10~4/cm~2)、融合状态(2.5×10~4/cm~2)、融合后状态(3.5×10~4/cm~2)。检测4种融合状态细胞矿化诱导前后p75NTR、Runt相关转录因子2(Runx2)和碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col1)在mRNA水平和蛋白水平的表达,茜素红染色检测钙盐沉积情况。结果矿化诱导0 d时,p75NTR mRNA和蛋白在融合状态组表达最高,Runx2、ALP、Col1在4种融合状态表达水平无明显差异。矿化诱导3、7 d时,融合状态组p75NTR、Runx2、ALP mRNA表达水平均显着高于其他3组(P<0.05);同时融合状态组p75NTR、Runx2、Col1蛋白表达水平最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。矿化诱导21 d时,融合状态组钙盐沉积量高于其他3组(P<0.01)。结论不同融合状态p75NTR表达差异显着,在融合状态组p75NTR表达最高,此时细胞矿化能力最强,表明p75NTR的表达与矿化呈正相关。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2018年09期）
李刚[5]（2017）在《P75NTR激活Wnt通路促进外胚间充质干细胞矿化的调控机制研究》一文中研究指出研究背景:牙齿缺失是每一个人的一生中都无可避免的需要面临的问题,目前,对于牙齿缺失的解决方法,通常为:活动义齿、固定桥修复及种植牙。但是,活动义齿的功能性不足、固定桥修复中需要制备基牙、种植牙需要患者接受种植手术,所以,以上所述的方法均不是最为理想的缺失牙修复方式,因此,组织工程化牙齿就成为了大多数口腔科研工作者共同研究的目标。牙齿发育是一个复杂的过程,期间牵涉了众多的分子和信号通路,既包括牙釉质、牙本质、牙骨质和牙髓等不同组织之间的协调发育,又包括切牙、尖牙、前磨牙和磨牙不同部位的发育。因此,明确牙齿发育过程中的分子生物学机制,成为解决组织工程化牙齿的一大难题。颅神经嵴源性外胚间充质干细胞可以用作研究牙齿发育过程中分子生物学机制的载体细胞。外胚间充质干细胞被认为是除牙釉质以外所有牙齿资质的源细胞。这些细胞在胚胎发育期间,从颅神经嵴迁移到上颌和下颌的颌突位置,与牙源性上皮相互作用形成牙囊和牙乳头,其进一步分化成各种牙齿组织并形成牙骨质、牙周膜、牙槽骨、牙本质和牙髓。在牙胚发育的蕾状期,诱导牙齿形成的信号从上皮传递到间充质,牙源性上皮可以诱导间充质干细胞形成牙齿,这就是经典的上皮-间充质相互作用理论。颅神经嵴源性外胚间充质干细胞在这个过程中发挥了重要的作用。然而,牙齿发育过程中的确切分子机制仍不清楚,因此,研究牙齿发育过程中的分子生物学机制,对于组织工程化牙齿的研究进展尤为重要。P75神经营养因子受体(P75NTR)属于肿瘤坏死因子超家族的低亲和力神经营养因子受体。P75NTR是第一个被分离的神经营养受体,并在早期发育期间在神经细胞中高度表达,参与胚胎发生过程中神经嵴干细胞的增殖、迁移、分化、存活和凋亡。P75NTR在不同的细胞系中表现出不同的生物效应,在我们前期的研究发现,经P75NTR纯化后的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞,具有成神经、成肌、成软骨和成骨等多向分化能力。探寻P75NTR是否参与牙齿发育过程,以及其怎样调控牙齿发育的过程,并在此基础上研究其具体的分子生物学机制,是本课题重点解决的科学问题。方法:第一部分:我们首先针对牙胚发育的两个关键时间点12.5天和19.5天,通过腹部外科手术,在同一只SD孕鼠体内获取胚胎发育12.5天和19.5天的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞(ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs)。对两种不同时间点的细胞采用流式细胞技术进行干细胞表面分子标志物及P75NTR的检测。干细胞具有较强的多向分化潜能,为了进一步比较两个不同时间点细胞的分化能力差异,对两种细胞进行了成骨定向诱导分化实验,同时采用Real Time PCR以及western blot对成骨的关键基因ALP、RunX2进行了检测。通过碱性磷酸酶染色,更加直观的对比ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs的成骨分化差异。第二部分:明确P75NTR在牙胚发育过程中的作用。为了证明P75NTR参与牙胚发育,并明确其在牙胚发育过程中起着怎样的作用,我们进一步使用RNA干扰技术沉默P75NTR以及慢病毒转染技术过表达P75NTR,采用细胞免疫荧光染色鉴定沉默及过表达效率,Real Time PCR以及western blot检测ED19.5EMSCs中P75NTR的表达情况。分别将沉默及过表达后的细胞进行成骨定向诱导,在诱导的0天、14天、21天,采用Real Time PCR及western blot检测其P75NTR及成骨关键基因ALP、Run X2的表达情况。碱性磷酸酶染色及茜素红染色比较在成骨诱导不同时间点,ED19.5EMSCs的分化情况。第叁部分:为了明确P75NTR参与牙胚发育过程中的分子生物学机制。我们采用P75NTR+ED12.5EMSCs以及P75NTR+ED19.5EMSCs制备Affymetrix表达谱芯片。通过对芯片结果的GO以及Pathway分析,发现Wnt信号通路在其中起着重要作用。采用Real Time PCR以及western blot在ED19.5EMSCs中检测Wnt信号通路的相关基因sost、Lrp6、β-catenin、LEF1以及CCND1。来进一步说明P75NTR在ED19.5EMSCs中是通过Wnt信号通路来参与成骨分化过程的。第四部分:牙齿发育这个复杂的过程,有着众多的分子以及信号通路参与其中,为了验证P75NTR确实参与了ED19.5EMSCs的成骨分化过程,而不是分化过程中的一个伴随现象。我们使用慢病毒转染过表达P75NTR并同时使用质粒转染过表达sost,采用Real Time PCR以及western blot检测了Lrp6、β-catenin、LEF1以及CCND1。并通过茜素红染色,更加直观的观察不同方法处理后的ED19.5EMSCs矿化结节的形成情况。结果:第一部分:ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs生物学行为的比较研究1.通过干细胞分子表面标记物检测发现表达相似的细胞表型,CD45-但是CD29+、CD44+、CD90+、CD105+、CD146+。2.ED19.5EMSCs中P75NTR的表达要显着高于ED12.5EMSCs。3.Real-time PCR及westernblot结果显示:ED19.5EMSCs在成骨诱导14天后成骨关键基因ALP、RunX2的表达水平显着高于ED12.5EMSCs。4.碱性磷酸酶染色结果显示:ED19.5EMSCs的矿化结节数量在成骨诱导14天后要多于ED12.5EMSCs。第二部分:明确P75NTR对ED19.5EMSCs骨向分化能力的影响1.沉默P75NTR后ED19.5EMSCs中的P75NTR表达水平下降;过表达P75NTR后ED19.5EMSCs中的P75NTR表达水平上升。2.细胞免疫荧光染色结果显示:沉默以及过表达均取得了较好的效率。3.Real-time PCR以及western blot结果显示:沉默P75NTR后,成骨关键基因ALP、Run X2表达下降;而过表达P75NTR后,ALP、RunX2的表达上升。在成骨诱导14天后,实验组和对照组之间就具有明显差异。4.碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示:成骨诱导14天后,碱性磷酸酶染色实验组和对照组之间矿化结节数量具有显着差异;成骨诱导21天后,茜素红染色实验组和对照组之间矿化结节数量具有显着差异。第叁部分:P75NTR在ED19.5EMSCs中对Wnt经典通路的作用研究1.Affymetrix表达谱芯片结果显示:Wnt经典通路在ED19.5EMSCs中具有重要作用。2.Real-time PCR结果显示:沉默P75NTR后,Wnt通路关键基因sost、Lrp6、β-catenin、CCND1的表达水平下降;过表达P75NTR后,sost、Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平上升。3.Western blot结果显示:沉默P75NTR后,P75NTR、β-catenin、Lrp6表达下降,sost表达上升;过表达P75NTR后,P75NTR、β-catenin、Lrp6表达上升,sost表达下降。第四部分:P75NTR通过Wnt信号通路影响ED19.5EMSCs的成骨分化能力的分子机制研究1.Real-time PCR结果显示:过表达P75NTR后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平最高;过表达sost后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平最低;而同时过表达P75NTR和sost后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平要高于过表达sost组,但低于过表达P75NTR组。2.Western blot结果显示:过表达P75NTR后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平最高;过表达sost后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平最低,sost表达水平最高;而同时过表达P75NTR和sost后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平要高于过表达sost组,但低于过表达P75NTR组。3.茜素红染色结果显示:过表达sost组矿化结节数量最少,过表达P75NTR组矿化结果数量最多;同时过表达P75NTR和sost后,矿化结节数量要低于过表达P75NTR组,但要高于过表达sost组,同时其高于空白对照组,说明,在ED19.5EMSCs的成骨分化过程中sost的抑制作用要低于P75NTR的促进作用。结论:1.本研究成功在同一SD孕鼠体内获取了不同胚胎发育时间点的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞,通过对比发现,ED19.5EMSCs具有更强的成骨分化潜能。2.本研究发现了P75NTR在ED19.5EMSCs中对于成骨分化能力具有促进作用。3.Wnt通路在ED19.5EMSCs中具有重要作用,P75NTR可以正向调控Wnt信号通路的活性。4.P75NTR通过抑制sost的活性,激活Wnt通路,进而在ED19.5EMSCs中促进其成骨分化能力。综上所述,我们的研究结果表明Wnt通路在ED19.5EMSCs中发挥主导作用,P75NTR可以负向调节sost,激活Wnt信号通路活性,进而促进成骨分化。本研究不仅加深认识颅神经嵴源性外胚间充质干细胞在牙齿发育过程中的骨向分化作用,而且提示可以通过调控P75NTR改变Wnt信号通路作用下颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的骨向分化能力,为组织工程化牙齿的研究提供新的理论和实验依据。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2017-05-01）
王莹莹[6]（2017）在《p75NTR敲除小鼠外胚间充质干细胞矿化能力的研究》一文中研究指出研究背景牙齿缺失是人一生中常见的口腔问题,牙齿缺失不仅会对人体健康产生影响,同时还会对患者面部美观、心理健康产生影响。传统的牙齿缺失修复方式即为义齿修复,但其在功能及感觉方面,都无法与天然牙相媲美。因而组织工程牙齿无疑被认为是将来解决牙齿缺失最为理想的方式。颅神经嵴源性的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)被认为是除牙釉质外所有牙齿组织始祖生成细胞。本课题组前期研究发现,处于牙胚钟状期的EMSCs较其他时期的EMSCs具有更好的体外矿化能力。p75NTR(p75 neurotrophin receptor,神经营养因子受体)为神经营养因子低亲和力受体,不仅是颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的经典表面标记物,同时还参与了细胞增殖、迁移、分化、生存、凋亡等生物学过程的调控。p75NTR参与神经系统的发生发育中的调控作用已被充分探究,但其参与神经系统以外组织(如肝脏、肌肉、脂肪、牙齿等)的发生发育过程的研究却仍处于起步阶段。尤其是在牙齿发育中的可能的调控作用鲜有报道。本研究借助于来源于美国Jackson实验室的p75NTR敲除小鼠,利用E18.5d处于牙胚钟状期的胚胎进行p75NTR(-/-)EMSCs及p75NTR(+/+)EMSCs的矿化分化能力差异的比较,探究p75NTR敲除对EMSCs矿化能力的影响,为进一步明确p75NTR影响EMSCs矿化发育可能的分子机制,揭示牙齿发生发育的分子生物学机制提供理论依据及实验支持。研究内容1、E18.5d颌突EMSCs的获取、培养、基因型鉴定和生物学特性检测将p75NTR(-/+)雌性小鼠及p75NTR(-/+)雄性小鼠配笼,常规饲养,小鼠从见阴栓午间为胚胎0.5d,并于孕18.5d时行2%戊巴比妥钠(50mg/kg)小鼠腹腔麻醉注射,5-10分钟后行腹腔手术,无菌条件下取出胚胎,于生物安全柜中PBS冲洗并切取颌突组织,尽量切碎组织使其为0.1mm*0.1mm*0.1mm的组织块,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心,去除上清后加入约2ml含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEMF12培养基,重悬于六孔板中,放置于含5%CO2的37℃孵育箱中培养。切取胎鼠的尾巴及四肢组织行基因型鉴定。并分别从细胞形态学、流式细胞检测细胞表面抗原及细胞周期等方面对两种基因型EMSCs进行检测、鉴定。2、E18.5d p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs矿化能力的检测分别对p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs进行体外矿化诱导,以检测其矿化分化能力的差异。矿化诱导液为10-8M地塞米松、50 g/L抗坏血酸、100ml/L胎牛血清及10 mmol/Lβ甘油磷酸钠配制的α-MEM培养液。每3天换一次液。分别矿化诱导第7天行ALP染色,第21天行茜素红染色,并分别收集诱导第7天、14天、21天的细胞RNA,以检测矿化相关基因ALP、Col I随矿化诱导的变化,明确p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs体外矿化诱导能力的差异。3、p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠骨矿化发育情况的研究选取同窝p75NTR(-/-)小鼠及p75NTR(+/+)小鼠,常规饲养至4个月。挑选雄性小鼠,以50mg/kg的2%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉后,脱颈处死。剥脱分离左侧股骨,放于4%多聚甲醛中固定组织,借助Micro-CT(viva ct40 Scanco Medical AG;Brüttisellen,Switzerland)进行扫描,并利用其配套软件后期进行叁维图像重建及数据分析;选取同窝p75NTR(-/-)小鼠及p75NTR(+/+)雄性小鼠,常规饲养40天时行钙黄绿素荧光标记实验,即每间隔5天注射钙黄绿素(25mg/kg,sigma),共4次,并于最后一次腹腔注射2天后脱颈处死小鼠,剥脱分离出小鼠左侧股骨,行硬组织切片,并观察计算荧光带之间的距离,计算出每种小鼠股骨各自的平均每天矿化沉积率(mineral apposition rate,MAR),单位为um/d;提取4周龄大p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠股骨总RNA及蛋白质,通过RT-PCR和Western blot法检测矿化相关基因ALP、Runx2的表达水平。结果1、(1)切除颌突组织后剩余组织进行基因型鉴定,结果在280bp处单条带者为p75NTR(-/-),345bp处单条带者为p75NTR(+/+),在280bp、345bp处双条带者为p75NTR(-/+)。(2)E18.5d的p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs分别从相应的p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)胚胎颌突组织中获取,两种基因型EMSCs在细胞形态上均为明显的长梭形的成纤维细胞形态,无明显差异。(3)流式细胞检测细胞表面抗原检测结果:p75NTR(-/-)EMSCs的CD14(99.07%)、CD146(95.79%)、CD166(95.79%);p75NTR(+/+)EMSCs的CD14(97.57%)、CD146(96.32%)、CD166(97.90%)。两种基因型细胞的CD45均为阴性表达结果,分别为0.28%和0.50%。(4)细胞周期检测结果显示p75NTR(-/-)EMSCs的G1期(77.65%)、G2期(17.01%)、S期(7.56%);p75NTR(+/+)EMSCs的G1期(79.25%)、G2期(15.27%)、S期(8.90%),二者之间细胞周期无明显差异。2、(1)碱性磷酸酶染色结果:矿化诱导7d后,p75NTR(+/+)EMSCs组染色较p75NTR(-/-)EMSCs组深。(2)茜素红染色结果:矿化诱导21天后,各组均有矿化结节形成,p75NTR(+/+)EMSCs组染色较p75NTR(-/-)EMSCs组深,且矿化结节量多。(3)RT-PCR结果:矿化诱导7天、14天、21天后,各组提取总RNA,逆转录后进行PCR反应,结果发现矿化诱导7天、14天和21天时均为p75NTR(+/+)EMSCs组ALP表达水平明显高于p75NTR(-/-)EMSCs组(P﹤0.05);Col I也表现为相同结果(P﹤0.05)。3、(1)Micro-CT扫描4月龄大同窝p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠左侧股骨,扫描后经叁维重建及数据分析结果:松质骨的BV(骨量),BV/TV(骨体积分数),Tb.N(骨小梁数),Tb.Th(骨小梁厚度),均为p75NTR(-/-)小鼠较p75NTR(+/+)小鼠为低,而BS/BV(骨表面积/骨量),Tb.Sp(骨小梁分离度),则为p75NTR(-/-)组小鼠高于p75NTR(+/+)组小鼠;同段股骨皮质骨的分析结果:Ct.TBTh(骨皮质厚度)及Ct.BV(骨皮质骨量)均为p75NTR(-/-)组小鼠较p75NTR(+/+)小鼠组为低,但Ct.BS/BV(骨表面积/骨量)则为p75NTR(-/-)组小鼠高于p75NTR(+/+)小鼠组。(2)钙黄绿素荧光标记检测结果显示p75NTR(-/-)组小鼠股骨的平均矿化速率明显低于同窝p75NTR(+/+)组小鼠(P<0.01);(3)PCR及Western blot结果显示p75NTR(-/-)组小鼠的ALP、Runx2基因表达水平明显较p75NTR(+/+)组小鼠组低(p<0.01)。结论1、通过两种基因型EMSCs的培养及矿化能力检测,发现p75NTR参与了小鼠外胚间充干细胞EMSCs的矿化分化能力的调控,并且p75NTR敲除对EMSCs的矿化分化能力存在负性调控作用;两种基因型细胞之间细胞周期无明显差异,说明p75NTR敲除后对EMSCs矿化分化能力负性调控作用的实现并不涉及细胞增殖能力、凋亡情况的改变。2、p75NTR敲除小鼠不表达具有结合NGF能力的p75NTR,Micro-CT检测、钙黄绿素荧光标记实验、RT-PCR及Western blot检测发现p75NTR(-/-)组小鼠股骨矿化形成能力明显低于p75NTR(+/+)小鼠组,因此我们初步猜测p75NTR对小鼠骨的矿化形成能力的调控是通过结合NGF实现的。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2017-04-01）
行勇军[7]（2016）在《神经嵴来源外胚间充质干细胞在牙向分化中的潜能及相关机制的研究》一文中研究指出长期以来,因龋病、牙周病、创伤等原因造成的牙齿缺失对人类造成较大的困扰,包括种植牙在内的各种缺失牙修复方法各有其局限,尚不能完全恢复缺牙患者的生理和心理功能。牙组织工程和牙再生医学的出现提供了一条更为适宜的思路,即重新启动牙齿发育进程,以修复牙体、牙周组织缺损,直至全牙再生。在牙组织工程中,适宜种子细胞的选择是组织工程叁要素中最为重要的内容。神经嵴来源的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)和外胚层来源的上皮细胞的连续相互作用贯穿于牙形态发生的始终。在经典的牙发育理论中,牙齿的发生是由这两个胚层细胞经复杂的上皮-间充质相互作用,并伴随着按严格时-空顺序表达的信号分子“瀑布”调控完成的。在胚胎发育早期,神经嵴细胞从中、后脑的神经嵴经上皮-间充质转化、脱层后迁移至第一腮弓,并组成第一腮弓的大部分组织,此时称为外胚间充质干细胞。牙板形成后,牙齿发育开始启动,牙板上皮来源的信号分子传递至其下方神经嵴来源的EMSCs,引起其增殖、凝聚,经牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期等明确的牙齿发育阶段,在釉质形成后,牙根发育启动并最终萌出至咬合平面,完成牙齿的发育。在这一过程中,神经嵴来源的EMSCs形成了除牙冠釉质外全部牙体组织结构,包括其派生的牙乳头间充质细胞,其最终分化为成牙本质细胞并分泌基质,形成牙髓-牙本质复合体、以及其派生的牙囊祖细胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs)最终形成的牙骨质、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可见,牙齿发育早期的EMSCs具有双向分化特性,即向成牙本质细胞和牙囊祖细胞及其子代细胞分化的特性,理论上EMSCs作为牙组织工程的种子细胞,具有形成除釉质外牙齿全部结构的能力。但这一胚胎发育过渡性的干细胞在体外诱导环境下,是否具有牙向分化能力,尚待进一步明确。再者,目前牙发育相关研究表明,尚有非神经嵴来源的间充质参与牙形态发生,牙组织工程相关研究也提示,除了神经嵴来源的牙齿间充质干细胞,非神经嵴来源的间充质干细胞,如骨髓间充质干细胞等也可表达牙向分化能力。神经嵴源性和非神经嵴源性的间充质干细胞作为牙组织工程的种子细胞,哪一个更为适宜,尚无明确定论。因此,目前有叁个亟待解决的问题:(1)神经嵴来源的EMSCs在体外牙向诱导环境下是否具有牙向分化能力?(2)神经嵴来源的emscs作为种子细胞,和非神经嵴来源的间充质干细胞比较,其成牙潜能如何?(3)牙胚的发生是通过口腔上皮与颅颌神经嵴来源emscs细胞间的信号分子网络调控、进而推动的复杂发育过程,而胚胎发育早期emscs参与牙齿发育的内在分子调控机制尚待进一步明确。因此,研究牙发育早期emscs的成牙潜能和内在分子机制,可以为完善牙发育学理论,以及为牙组织工程的种子细胞选择和构建组织工程牙胚,提供初步的依据和策略。主要研究内容和结果目的:本课题主要对比研究大鼠胚胎11.5d(e11.5d)第一腮弓神经嵴来源的emscs和非神经嵴来源的emscs,在体外、体内成牙诱导微环境下的成牙潜能差异;利用细胞凝聚技术还原牙齿器官发育模式,从上皮-间充质相互作用和牙发育角度探讨明确的神经嵴来源的emscs在体外、体内的牙向分化模式;进一步以基因芯片技术探讨神经嵴来源的emscs在牙向分化过程中可能存在的分子机制,为牙发育机制和牙组织工程再生提供可能的理论依据和策略。方法:1.为明确p75-ntr标记的emscs在牙发育中的时空变化,我们通过对e11.5-e18.5d大鼠胚胎牙齿不同发育阶段的连续观察,利用he和ihc技术对比观察神经嵴细胞的标记物,p75神经营养因子受体(p75-neurotrophinreceptor,p75-ntr)以及胚胎干细胞标记物oct4和sox2,在牙发育各个时期emscs中的时空表达和生物学功能;2.为获取明确的神经嵴来源的emscs,我们以流式细胞技术分选e11.5d大鼠胚胎第一腮弓来源的p75-ntr阳性emscs(p_(75)~+emscs),原代细胞培养后进行增殖能力检测和干细胞鉴定;3.为明确p_(75)~+emscs是否具有牙向分化能力,及探讨与非神经嵴来源的p75-ntr阴性emscs(p75-emscs)的牙向分化能力差异,我们利用大鼠切牙颈环上皮干细胞系hat-7条件培养液和切牙颈环上皮干细胞,通过体外、体内诱导模式对p75进行牙向分化诱导。体外诱导模式下以hat-7条件培养液诱导0、4、8、12d后观察细胞形态变化,透射电镜(tem)检测诱导前后的细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期变化;对比p75和蛋白dsp、dmp1等变化;体内诱导模式下,以原代大鼠切牙颈环上皮干细胞重组p_(75)~+emscs/p75-emscs(细胞比例2:3),以i型胶原蛋白为重组体支架,待细胞自发凝聚后,大鼠肾被膜下移植,4周后取材进行ihc鉴定成牙关键蛋白dsp和dmp1表达;4.为进一步探讨神经嵴和非神经嵴来源的emscs牙向分化差异的分子机制,我们以基因芯片微阵列分析e11.5dp_(75)~+emscs和p75-emscs基因表达谱差异基因,kegg代谢通路分析牙发育相关信号通路。然后以sirna-smad4沉默p_(75)~+emscs的tgf-β信号通路关键蛋白smad4,smad4激活剂kartogenin激活p75-emscs的smad4表达,以上两组细胞在hat-7条件培养液牙向分化诱导后,以westernblot检测tgf-β信号通路关键蛋白smad4对p_(75)~+emscs和p75-emscs牙向分化能力的影响。结果:1.p75-ntr作为公认的神经嵴细胞的标记物,在牙齿各个发育时期的牙源性间充质中都连续表达,可以作为神经嵴来源的emscs的连续标记物。其同时在牙上皮表达,显示其参与了上皮和间充质的相互作用;胚胎干细胞的标记物oct4和sox2的表达在牙发育早期表达较弱,在牙发育后期(钟状期)的上皮-间充质界面强烈表达,显示其协同p75-ntr调控上皮-间充质相互作用;2.分选前emscs形态具有高度异质性,显示不同族群的细胞杂居生长。分选后的p_(75)~+emscs呈短梭叁角形,形态趋于一致。p_(75)~+emscs分选比率为24.5%提示其在第一腮弓组织中有较高的比率。细胞增殖实验显示p_(75)~+emscs的增殖能力显着高于p75-emscs。免疫荧光鉴定p_(75)~+emscs具备间充质干细胞表面抗原(stro-1、vimintin)和神经嵴细胞(p75-ntr,ap2α,hnk-1)双重标记物,同时胚胎源性标记物oct4阳性,提示为具有神经嵴源性和间充质干细胞双重特性的外胚间充质干细胞(emscs);3.p_(75)~+emscs在体外成牙诱导模式下细胞形态、细胞周期、细胞增殖、细胞超微结构变化以及高表达成牙本质细胞标记物dspp(dsp)和dmp1,证实细胞分化为具有分泌功能的成牙本质细胞样细胞。p_(75)~+emscs的成牙本质细胞标记物dspp和dmp1的mrna显着高于p75-emscs。体内在牙源性上皮干细胞的诱导下,p_(75)~+emscs呈一定层次围绕岛型牙源性上皮,强烈表达dsp和dmp1,而p75体外、体内两种成牙诱导模式下证实,p75p75-emscs;4.对比p75≥1.5),kegg代谢通路分析显示涉及多个信号通路,其中tgf-β信号通路与牙齿发育密切相关。在差异基因中,smad4是tgf-β信号通路中的关键节点。westernblot和Real-time PCR的结果也证实P_(75)~+EMSCs的Smad4表达水平显着高于P75-EMSCs。P_(75)~+EMSCs经特异性的si RNA-Smad4沉默后,其成牙能力相应受到抑制,而P75-EMSCs经smad4激活剂激活后,其成牙能力显着增加。这一结果表明,P_(75)~+EMSCs较P75-EMSCs具有更为活跃的成牙分化潜能的机制,可能在于其通过smad4介导的TGF-β信号通路实现。结论:综上所述,E11.5d大鼠胚胎腮弓来源的P_(75)~+EMSCs作为明确的神经嵴来源的外胚间充质干细胞,对比非神经嵴来源的P75-EMSCs,在体外和体内两种成牙诱导模式下都显示更为活跃的牙向分化潜能。这一能力可能是通过Smad4为核心的TGF-β/Smad4信号通路介导获得的。P_(75)~+EMSCs有希望作为一种新的干细胞资源,为研究完善牙发育理论,以及牙组织工程和牙再生医学提供帮助。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-05-01）
杨琨[8]（2016）在《P75NTR对颌突外胚间充质干细胞矿化分化能力的影响研究》一文中研究指出研究背景:口腔健康与牙齿的健康是社会文明进步的重要标志之一,也是提高生命与生活质量不可缺少的一部分。然而,我国的牙齿缺失问题相当严重,第叁次全国口腔健康流行病学调查结果显示,全国65-74岁老年人有牙齿缺失者为86.1%,10%以上的老年人有全口牙缺失,严重影响口腔功能与全身健康;已有数据显示,2005年底,我国老年人口已达到1.44亿,占全国总人数的11%,到21世纪中期,老龄人口将达到30%。社会的老龄化更加突显这一问题的严重性和解决的迫切性。组织工程化牙齿被认为是未来解决这一问题最为理想的手段,也是近年来口腔医学最为活跃的研究领域之一,特别是干细胞生物学的飞速发展,成就了组织工程化牙齿研究赖以生存的基础。来源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)是除牙釉质以外所有牙齿组织的生成细胞,被认为是上述牙源性干细胞的始祖细胞。p75NTR(p75neurotrophin receptor,神经营养因子受体),被认为是神经嵴源性干细胞的特异性表面标志物,可用以分选神经嵴来源的外胚间充质干细胞。研究显示,p75NTR在胚胎发育过程中参与多种组织(包括神经、脂肪、肝脏、牙齿等)的形态发生和发育。尽管p75NTR在神经系统的发育过程中的重要作用已得到充分阐述,然而参与调控神经以外组织(如脂肪、肝脏、肌肉、牙齿等)形态发生的研究尚处起步阶段,特别是其在牙齿发生、发育中的潜在调控作用鲜有报道。本研究着重在p75NTR对外胚间充质干细胞矿化分化能力的影响,结合其胞内“连接伙伴”Mage-D1,NGF高亲和力膜受体Trk A及其配体NGF,阐述p75NTR对外胚间充质干细胞矿化分化能力影响的机制。为了解牙齿发生、发育机制提供理论依据,为进一步发展牙组织工程化牙齿提供实验基础。材料与方法:1.不同胚胎时期颌突外胚间充质干细胞获得、体外培养及生物学特性检测SD大鼠胚胎12.5天外胚间充质干细胞组(E12.5d EMSCs);SD大鼠胚胎19.5天外胚间充质干细胞组(E19.5d EMSCs)体外培养与生物学特性检测:SD大鼠胚胎12.5天外胚间充质干细胞组(E12.5d EMSCs):选择SD大鼠从见阴栓午间为胚胎0.5d,第12天午间以40mg/kg注射2%戊巴比妥钠,行腹腔手术,取出3-5个胚胎后,分层缝合,待孕鼠苏醒后标记好继续饲养。取出的胚胎切取颌突组织,PBS缓冲液冲洗,眼科剪尽量剪碎组织,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心,去上清后将组织均匀平铺于6cm培养皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4-5ml,置于含5%CO_2的恒温箱中培养,37℃。SD大鼠胚胎19.5天颌突外胚间充质干细胞组(E19.5d EMSCs):以E12.5d手术后孕鼠继续饲养胚胎第19.5天,第19.5天午间以40mg/kg注射戊巴比妥钠,行腹腔手术,取出3-5个胚胎。取出的胚胎分离上下颌,显微镜下用眼科镊取出牙胚组织,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心1000r/min,3min,去上清后将组织均匀平铺于6cm培养皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4-5ml,置于含5%CO_2的恒温箱中培养,37℃。分别从细胞形态学、细胞增殖、流式细胞检测表面分子等方面对两种EMSCs进行检测、鉴定。2.P75NTR及相关矿化基因Runx2在颌突及牙胚中时空表达的检测免疫组织化学方法检测p75NTR及相关矿化基因Runx2在大鼠胚胎颌突及牙胚中的时空表达。分别于胚胎E12.5d及E19.5d取大鼠胚胎头部,4%多聚甲醛固定24h,以6um厚度冠状切片方向作冰冻切片,p75NTR及Runx2相应一抗作常规免疫组化染色。3.对比不同时期颌突外胚间充质干细胞矿化能力差别体外矿化诱导E12.5d及E19.5d颌突外胚间充质干细胞,对比两者矿化能力区别。利用矿化诱导液(以50 g/L抗坏血酸、10 mmol/Lβ甘油磷酸钠、10-8M地塞米松及100ml/L胎牛血清配制α-MEM矿化诱导液)每3天换液1次。矿化诱导第7天收集RNA,逆转录为c DNA后进行Real Time-PCR检测相关基因表达趋势及ALP染色,诱导第14天进行收集蛋白进行western blot检测相关蛋白趋势,第28天进行茜素红染色,观察矿化结节形成情况。4.外胚间充质干细胞矿化诱导过程中p75NTR及相关基因表达检测体外矿化诱导E19.5d颌突外胚间充质干细胞,分别在矿化诱导的3天,7天,14天,21天提取细胞RNA,收集蛋白及细胞培养基。利用Real Time-PCR,western blot及IP检测相关基因蛋白水平及p75NTR与Mage-D1结合表达的变化,ELISA法分析细胞培养基中NGF在不同诱导时期的细胞分泌量变化,免疫共沉淀检测p75NTR与Mage-D1在矿化诱导过程中蛋白之间相结合的变化趋势。5.P75NTR调控外胚间充质干细胞矿化能力的检测利用p75NTR过表达质粒pLJM1-P75包装入慢病毒,感染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,上调p75NTR在目的细胞中表达;利用p75NTRsiRNA转染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,下调p75NTR在目的细胞中表达,实验分为4组:p75siRNA(转染p75NTRsiRNA组)、NCon(阴性对照组)、pLJM1-P75(p75NTR过表达质粒pLJM1慢病毒感染组)、pLJM1(空载体组)。在矿化诱导第7天提取各组RNA进行Real Time-PCR检测相关基因表达变化及ALP染色,矿化诱导第14天收集各组蛋白进行Western blot检测相关蛋白表达变化,矿化诱导第28天进行各组茜素红染色,观察矿化结节形成情况。利用CCK-8试剂盒检测pLJM1-P75与pLJM1组外胚间充质干细胞增殖能力的变化。6.Mage-D1及NGF对颌突外胚间充质干细胞矿化能力的影响利用Mage-D1siRNA转染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,下调Mage-D1在目的细胞中的表达;利用100ng/ml NGF作为p75NTR上游配体及激活剂,处理目的细胞,上调p75NTR表达,实验分为3组:NCon(阴性对照组)、Mage-D1siRNA(转染Mage-D1siRNA组)、NGF(100ng/ml NGF处理组)。在矿化诱导第7天提取各组RNA进行Real Time-PCR检测相关基因表达变化及ALP染色,矿化诱导第14天收集各组蛋白进行Western blot剂IP检测相关蛋白表达及p75NTR与Mage-D1结合表达变化。7.实验动物模型的制作培养、鉴定及P75NTR基因敲除小鼠Micro CT扫描P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR杂合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠背景均为129/sv(均源于美国Jackson实验室),将p75NTR-/-小鼠、p75NTR+/-小鼠及野生型交配,成功交配生产繁殖后,于出生后第10天剪去小鼠尾巴2mm,做好标记,提取DNA,利用QIAGEN Master Mix试剂盒进行基因型鉴定。同一天生产的同窝P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR杂合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠,常规饲养至60天。随机挑选性别,以50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,脱颈处死。分离干净股骨,置入4%多聚甲醛固定组织,于Micro CT(viva ct40 Scanco Medical AG;Brüttisellen,Switzerland)进行扫描,后利用其配套软件进行图形规划数据分析整理。结果:1.E12.5d EMSCs和E19.5d EMSCs分别从相应时期胚胎中颌突组织和牙胚组织中获取,E19.5d EMSCs在显微镜下观察,较E12.5d EMSCs细胞形态更显规则的纺锤状成纤维细胞形态。E12.5d EMSCs形成克隆集落及数目大小相较E19.5d EMSCs多及大。利用CCK-8试剂盒检测两者增殖能力的区别,E12.5d EMSCs增值能力较E19.5d EMSCs为高。流式细胞仪表面分子检测两种细胞相应表面分子表达,E12.5d EMSCs:CD14(90.4%),CD29(79.5%),CD44(92.8%),CD90(99.03%),CD105(29.3%),CD146(98.1%)和CD166(99.45%);E19.5d EMSCs:CD14(90.46%),CD29(98.93%),CD44(98.26%),CD90(99.64%),CD105(25.97%),CD146(97.39%)和CD166(97.22%)。两种细胞都阴性表达CD45,分别为:3.34%和2.08%。而神经嵴源性标志性表面分子p75NTR,E19.5d EMSCs的表达为92.89%,较E12.5d EMSCs表达23.1%显着性得增高。2.在牙发育起始期(E12.5d),p75NTR在增厚的口腔上皮中未见表达,但是在相对应的邻近间充质(浓聚间充质)中存在弱表达,且能在未来牙源性上皮间充质相互反应区域的间充质细胞中见表达。在牙发育钟状期(E19.5d),p75NTR在内釉上皮,牙囊,牙乳头接近上皮区域强表达,这些区域在牙发育后期会出现矿化作用。Runx2表达与p75NTR表达存在重迭区域。3.矿化诱导7天,E19.5d EMSCs的ALP染色深度高于E12.5d EMSCs。矿化诱导28天,茜素红染色显示,E19.5d EMSCs矿化结节形成的大小及数目相较于E12.5d EMSCs都为大及多。Real Time-PCR显示,E19.5d EMSCs p75NTR表达显着高于E12.5d EMSCs。对比两者矿化能力大小,矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2都与矿化及成牙相关,E19.5d EMSCs表达都高于E12.5d EMSCs。western blot和Real Time-PCR结果显示Mage-D1在两种细胞中的表达未见明显差异。并且两者都未见Trk A的表达。4.矿化诱导过程中,western blot和Real Time-PCR结果显示,E19.5d EMSCs的p75NTR表达随矿化诱导天数增加而不断增加。矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2与p75NTR趋势相同,Trk A未在矿化过程中存在表达。虽然Mage-D1表达在矿化过程中未见明显变化,但是免疫共沉淀结果显示,Mage-D1与p75NTR的结合强度随矿化诱导天数增加而不断增加。ELISA结果显示自分泌NGF分泌量随矿化诱导天数增加而不断增加,矿化诱导3天时为31.3±4.4 pg/ml,诱导21天后为378.3±10.9 pg/m。5.pLJM1-p75 EMSCs组p75NTR免疫荧光染色最深,Mage-D1的免疫荧光染色在四个实验组中未见明显差异。利用pLJM1质粒过表达p75NTR,慢病毒转染入E19.5d EMSCs,矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2表达随p75NTR过表达而增加。然而,利用P75NTR siRNA转染细胞,E19.5d EMSCs矿化相关基因也随着降低。ALP染色在pLJM1-p75 EMSCs组染色最深,而在p75siRNA EMSCs组染色最浅。茜素红染色矿化结节也显示,pLJM1-p75 EMSCs组矿化结节形成量多及形成较大。形态学显示pLJM1-p75 EMSCs组细胞的形态为更为规则的长梭形成纤维样细胞。但是pLJM1-p75 EMSCs组的细胞增殖能力较pLJM1 EMSCs组为弱。6.Mage-D1 siRNA组EMSCs ALP染色为最浅。相比较的是100ng/ml NGF组ALP染色为最深。与叁组细胞ALP染色的趋势相一致,western blot和Real Time-PCR结果显示矿化及成牙相关基因Runx2,Col1,同源盒基因Dlx5和Msx2表达量在Mage-D1 siRNA组为低,而在100ng/ml NGF组较高。但是Mage-D1在100ng/ml NGF处理组未见表达变化。而免疫共沉淀结果显示,Mage-D1与p75NTR结合在100ng/ml NGF处理组较高,而在Mage-D1 siRNA组较低。所有实验组中的EMSCs都是用的同一代EMSCs以及相同状态的EMSCs展开研究。7.P75NTR敲除小鼠基因型鉴定结果,单独呈现280bp条带为p75NTR敲除小鼠纯合子型,单独呈现345bp条带为野生型小鼠,而两条带都存在于同一泳道为p75NTR杂合型小鼠。Micro CT扫描60天同批次同窝小鼠股骨,叁组小鼠(P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR杂合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠)扫描后叁维重建数据分析结果:骨小梁骨的分析中TRI-BV(骨量),TRI-BV/TV(骨体积分数),TRI-Tb.N(骨小梁数),TRI-Tb.Th(骨小梁厚度),p75NTR-/-小鼠较p75NTR+/-及野生型小鼠为低,而TRI-BS/BV(骨表面积/骨量),TRI-Tb.Sp(骨小梁分离度),在p75NTR-/-小鼠中高于其他两组小鼠,同段股骨的骨皮质骨的分析中:骨皮质厚度TRI-C.TBTh以及骨皮质骨量TRI-C.BVp75NTR-/-小鼠较p75NTR+/-及野生型小鼠为低,但TRI-C.BS/BV在p75NTR-/-小鼠中高于其他两组小鼠。结论:1.成功体外培养获得高纯度E12.5d颌突来源外胚间充质干细胞及E19.5d牙胚来源外胚间充质干细胞,两种细胞经鉴定都为间充质来源细胞,且E12.5d颌突外胚间充质干细胞增殖能力高于E19.5d牙胚外胚间充质干细胞。但P75NTR表达及矿化能力E19.5d牙胚外胚间充质干细胞高于E12.5d颌突外胚间充质干细胞,且p75NTR与Runx2在牙发育各时期表达区域重迭,表明p75NTR在颌突及牙育前期与其矿化发育相关。2.p75NTR在外胚间充质干细胞矿化过程中表达随矿化时间不断增加,表明p75NTR介导外胚间充质干细胞矿化过程。3.在外胚间充质干细胞中过表达及干扰p75NTR表达,其矿化能力随趋势而变化,表明P75NTR正向调控外胚间充质干细胞矿化能力。4.P75NTR通过结合Mage-D1,影响矿化及成牙相关基因与同源盒基因表达,进而影响外胚间充质干细胞矿化能力的变化。5.P75NTR基因敲除小鼠,Micro CT扫描结果表明,p75NTR敲除导致骨发育不良。综上所述及本研究结果表明,P75参与胚胎颌面部及牙发育,且EMSC矿化作用可能由P75NTR与细胞内Mage D1相结合,进而影响成牙及矿化相关转录因表达变化,最终影响EMSC矿化能力,初步阐述颌面部发育期P75NTR参与的EMSC矿化机制,为颌面部发育及牙发育过程中细胞分化机制,牙发育组织工程提供理论基础及实验依据。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-05-01）
鞠迎新[9]（2016）在《p75NTR在大鼠颌突外胚间充质干细胞体外矿化过程中表达变化的研究》一文中研究指出研究背景牙齿缺失几乎是每个人一生当中必须面对的问题,特别是社会逐步进入人口老龄化的今天,这一问题尤为普遍,对人类健康的危害和生活质量的影响也越来越突出。目前临床上解决这一问题的主要手段是义齿,但无论是在功能还是感觉上,都无法与天然牙相比。因此需要一种与天然牙具有最为相似或者完全相同功能的修复体,无疑组织工程化牙齿是较为理想的选择,但由于牙齿发育的确切机制尚未明确,制约了组织工程化牙齿的发展进程。而模拟牙发育外胚间充质-上皮作用理论的细胞重聚技术为组织工程化牙齿发展注入新的理念,作为牙源性干细胞的始祖细胞——颅神经嵴来源的EMSCs是细胞重聚技术获得再生牙最为理想的种子细胞。但当前对颅神经嵴来源的EMSCs的体外分化命运及影响因素了解还远远不够。因此,通过探讨不同胚龄EMSCs的矿化能力,了解其体外分化命运,有助于推进组织工程牙齿的发展进程,同时为组织工程化牙齿探寻良好的种子细胞。p75神经营养受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)作为神经营养因子的低亲和力受体,主要表达在神经细胞的早期发育中,被认为是颅神经嵴的经典标志物,参与细胞的生存、增殖、迁移、分化和凋亡等多重生物学效应。目前,p75NTR在神经系统发育和再生中的调控作用已得到较充分阐述,但是参与神经系统以外组织(如脂肪、肝脏、肌肉、牙齿等)形态发生的研究尚处于起步阶段,特别是在牙齿发育过程中的作用鲜有报道。本课题组前期的研究已证实,颅神经嵴细胞于大鼠E11.5d迁移至颌突组织,E12.5d牙发育尚未启动。本实验在以往研究的基础上进一步通过比较p75NTR在不同胚龄大鼠颌突EMSCs体外矿化过程中的表达变化,初步探讨p75NTR在颌突EMSCs矿化过程中的作用,为揭示牙齿发育的分子生物学机制提供实验基础。研究内容1.HE染色观察不同胚龄大鼠牙胚的形态观察受孕12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手术取出胚胎,4%多聚甲醛固定24h,包埋,按矢状面方向切片,厚度为8μm,HE染色,显微镜下观察、拍照。2.E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d SD大鼠颌突EMSCs的体外培养及鉴定受孕E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手术,无菌条件下取出胎鼠,切取颌突,切成0.1mm*0.1mm*0.1mm的组织块,胰酶消化、离心,经不锈钢筛网过滤后分别加入含100ml/L胎牛血清的培养基,置于5%CO2 37℃孵育箱中培养。分别从细胞形态、细胞增殖能力、细胞免疫荧光、流式细胞技术检测细胞表面抗原对E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs进行生物学鉴定。3.E12.5d、E13.5d、E15.5d和18.5d EMSCs体外矿化诱导分别对E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d颌突EMSCs进行矿化诱导,于诱导0d、7d、14d、21d后分别观察细胞形态、ALP活性、矿化能力、矿化相关基因蛋白以及p75NTR的表达变化。结果1.E12.5d大鼠牙胚处于牙板形成期,口腔上皮向组织内部生长形成的一种上皮性结构;E13.5 d进入牙胚发育的蕾状期,此时牙胚的牙板末端膨大,上皮细胞增生形成卵圆形或圆形的上皮芽,形似花蕾。E15.5 d大鼠牙胚的上皮芽继续生长、增大,长入上皮基底部向内凹陷形似帽子,覆盖在外胚间叶细胞聚集区,称为帽状期,成釉器分为叁层细胞:即外釉上皮层、星网状层和内釉上皮层。其中成釉器下方的细胞聚集区称为牙乳头,形成牙本质和牙髓,包绕成釉器和牙乳头的外胚间叶细胞称为牙囊,形成牙支持组织。E18.5 d大鼠牙胚发育进入钟状期,上皮凹陷加深,周缘继续生长,形似吊钟,此时成釉器进入成熟期,分为4层细胞即外釉上皮层、星网状层、中间层和内釉上皮层,内釉上皮与外釉上皮相连处称为颈环。2.(1)体外分离、培养的E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs均为长梭型的成纤维样细胞,胞体丰满,细胞增殖能力强。(2)流式细胞检测:E12.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:92.93%、98.39%、95.49%、92.86%、91.44%、22.53%,E13.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:97.01%、96.64%、97.70%、98.26%、97.15%、82.42%,E15.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.65%、98.50%、98.49%、97.90%、99.51%、85.09%,E18.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.79%、96.97%、91.28%、97.92%、96.83%、81.43%,CD45在E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs表达率分别为:5.78%、5.24%、8.34%、8.51%。E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d颌突EMSCs均阳性表达CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR,阴性表达CD45。3.(1)碱性磷酸酶染色结果:矿化诱导7d后,各实验组染色较对照组深,E18.5d EMSCs实验组染色最深。(2)茜素红染色结果:矿化诱导21天后,各组均有矿化结节形成,其结果与ALP染色结果一致,即E18.5d EMSCs实验组矿化结节形成量最多。(3)RT-PCR结果:矿化诱导7天后,各组提取总RNA,逆转录后进行PCR反应,各实验组ALP表达水平明显高于对照组,其中E18.5d EMSCs表达较高(P﹤0.05);矿化诱导14d后,各实验组矿化相关基因Runx2、Col I以及p75NTR m RNA表达高于对照组,在E18.5d EMSCs实验组表达较高(P﹤0.05);对照组p75NTR的表达未见明显变化。(4)Western blot结果:矿化诱导14d,矿化相关蛋白Runx2、Col I表达量在E18.5d EMSCs实验组较高,蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P﹤0.05);矿化前期各组p75NTR蛋白未见明显变化,而21d后各实验组明显高于对照组,蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P﹤0.05),各对照组间未见明显变化。结论通过不同胚龄颌突外胚间充质干细胞的培养、生物学鉴定和体外矿化诱导,以及对矿化相关基因蛋白的检测,发现E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs均为颅神经嵴源性的间充质干细胞,其中E18.5d EMSCs增殖能力和矿化能力强,这说明E18.5d EMSCs是未来研究牙组织工程较为理想的种子细胞;流式检测发现p75NTR在E13.5d表达显着升高,并保持高表达,以及p75NTR在矿化诱导后表达明显升高,推测p75NTR可能参与成牙初期牙齿的发育。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-05-01）
贺清华[10]（2015）在《大鼠鼻黏膜外胚间充质干细胞的干细胞特性研究及其在治疗脊髓损伤中的应用》一文中研究指出目的：外胚间充质干细胞(Ecto-mesenchymal stem cells, EMSCs)是间充质干细胞的特殊类型,起源于胚胎时期的神经嵴(Neural crest),具有自我更新和多向分化潜能。本研究旨在探讨大鼠鼻黏膜来源的EMSCs的干细胞特性和多向分化潜能,并探讨其在纤维蛋白(Fibrin)支架上的多向分化潜能,为组织工程干细胞／支架移植寻找新的种子细胞。最后,将EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型,评价其对脊髓损伤的修复效果。方法:1.制作大鼠鼻黏膜冰冻切片,用EMSCs标志蛋白Nestin, CD133, CD44进行免疫荧光染色,观察其在大鼠鼻黏膜的分布特征。2.用差速贴壁法纯化EMSCs,并用成球实验及各种干细胞标志蛋白评价其干细胞特性。3.用成骨诱导培养基诱导EMSCs向成骨细胞分化。用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶活性；茜素红染色检测诱导后细胞表面钙结节来评价成骨诱导效果；用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达水平评价EMSCs向成骨细胞诱导分化的效果。4.用神经诱导培养基诱导EMSCs向神经细胞分化。用神经标志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200进行免疫荧光和蛋白免疫印迹,评价EMSCs向神经细胞的分化效果。5.用雪旺细胞诱导培养基诱导EMSCs向雪旺细胞分化。用雪旺细胞标志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase进行免疫荧光和蛋白免疫印迹,评价EMSCs向雪旺细胞的分化效果。6.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞进行Transwell非接触共培养,免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。7.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞接触共培养,活细胞动态摄影及免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。8.接触共培养体系中加入RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体,观察并简要探讨RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体对神经干细胞分化的抑制作用。9.用扫描电子显微镜检测(Scanning electron microscopy, SEM)及透射电子显微镜检测(Transmission electron microscopy, TEM)观察Fibrin支架的结构特征。EMSCs种植于Fibrin支架后,用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色评价EMSCs与Fibrin支架的生物相容性。10.用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测EMSCs在Fibrin支架上的自发分化情况。11用免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等方法检测EMSCs在Fibrin支架上向成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞的诱导分化效果(方法同上述3-5)。12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型,观察EMSCs在脊髓的迁移情况,BBB评分(Basso-, Beattie, Bresnahan scoring)评价大鼠后肢运动功能恢复情况。用免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等方法观察评价损伤脊髓神经元的再生情况。结果：1.鼻黏膜组织冰冻切片免疫荧光染色显示,CD 133, Nestin及CD44阳性细胞广泛分布于鼻中隔两侧黏膜固有层内。2.EMSCs在抗贴壁培养时,可形成CD 133, Nestin及Soxl阳性的干细胞球。差速贴壁纯化后的第叁代EMSCs显示出很强的干性,表达神经外胚层干细胞相关蛋白和间充质干细胞标志蛋白Nestin, Soxl, Sox10, S100, Snail, Vimentin, CD44, CD133, Sall4及含RGD序列细胞外基质的受体integrinβ1等。3.EMSCs经成骨诱导培养基诱导2周后,碱性磷酸酶活性明显增强,成骨细胞标志蛋白Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达量明显升高。诱导3周后,茜素红染色可观察到大量的钙结节。4. EMSCs用神经诱导培养基诱导培养14天后,神经标志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200的表达量明显升高。5. EMSCs用雪旺细胞诱导培养基诱导培养14天后,雪旺细胞标志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase的表达量明显升高。6. EMSCs与脊髓来源的神经干细胞的Transwell非接触共培养结果显示,共培养组神经突触的数量和长度明显增加,并可形成神经网络。7.EMSCs与脊髓来源的神经干细胞接触共培养结果显示,单神经细胞组细胞表达神经细胞标志蛋白GAP43及神经胶质细胞标志蛋白GFAP,而共培养组只表达GAP43,不表达GFAP。8.接触共培养体系中加入RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体后,神经纤维的生长受到抑制。9.SEM和TEM检测不同浓度Fibrin支架的结构发现低浓度(12.5-50mg/ml)的Fibrin支架呈疏松多孔的海绵状结构,并且随着浓度升高,孔径减小,密度增加。而当纤维蛋白浓度达到75 mg/ml,纤维蛋白胶则聚集成块状结构。HE染色结果显示,EMSCs在低浓度Fibrin支架上生长良好。10.免疫荧光和蛋白免疫印迹结果显示,EMSCs在Fibrin支架上培养12天后,可表达雪旺细胞标志蛋白CNPase, MBP, GalCer及雪旺细胞可分泌的神经营养因子BDNF, NGF, NT-3等。11.免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等结果显示,EMSCs在Fibrin支架上也可诱导分化为成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞,并且分化效果优于在L-多聚赖氨酸(poly-L-Lysine, PLL)对照组,而且EMSCs能够改建Fibrin支架,使其更利于细胞的生长。12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤模型,可观察到EMSCs从移植处向脊髓两端迁移。术后12周BBB评分结果发现大鼠后肢运动功能恢复情况良好,而对照组无明显恢复。免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等结果显示,EMSCs/Fibrin移植组神经再生相关蛋白GAP43, NF-200及MBP的表达量明显高于SCI组及Fibrin组,神经再生能力明显提高,神经细胞被很厚的髓鞘包被。结论：1. EMSCs广泛分布于嗅部和呼吸部黏膜固有层内,并具有很强的干性,具有向成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞分化的潜能。2.EMSCS与Fibrin支架生物相容性良好,并能在Fibrin支架上自发分化为雪旺细胞。3.EMSCs在Fibrin支架上能更有效的分化为成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞,并可以改建Fibrin支架,使之更利于EMSCs的生长分化。4.EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠横断脊髓损伤模型,能有效恢复大鼠后肢运动功能。EMSCs是组织工程中一种很有利用前景的种子细胞,可用于自体移植修复脊髓损伤。(本文来源于《江苏大学》期刊2015-04-01）
外胚间充质干细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的研究黑色素瘤相关抗原D1(Melanoma associated antigens,MAGE-D1)对大鼠牙胚来源的外胚间充质干细胞(Ectomensenchymal stem cells,EMSCs)增殖及迁移能力的影响。方法取SD大鼠孕19. 5 d胎鼠牙胚组织,组织块法培养牙胚来源外胚间充质干细胞,流式细胞仪进行外胚间充质干细胞表面分子鉴定CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR,MAGE-D1 siRNA转染入外胚间充质干细胞,实验组分为:对照组(Control)和MAGE-D1 siRNA组(MAGEsiRNA-EMSCs),CCK8法和划痕法分别检测两组细胞增殖能力与迁移能力,Real Time-PCR及Western blot检测迁移及WNT通路相关基因MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin的mRNA及蛋白表达量。结果组织块法成功培养出牙胚来源的外胚间充质干细胞,经流式细胞仪检测细胞阳性表达CD14(92. 16%)、CD29(94. 53%)、CD44(99. 51%)、CD90(95. 18%)、CD105(34. 22%)、CD146(92. 39%)、CD166(98. 15%)和p75NTR(88. 56%),阴性表达CD45(0. 5%);CCK8法检测MAGE-D1 siRNA组EMSCs增殖能力受到抑制;划痕试验法检测MAGE-D1 siRNA组细胞48 h迁移量高于对照组细胞;Real Time-PCR检测Mage-D1、β-catenin和E-cadherin表达量,MAGE-D1 siRNA组EMSCs MAGE-D1和E-cadherin表达较对照组低,而β-catenin表达较高,Western blot检测MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin表达水平趋势与Real Time-PCR结果相一致。结论抑制EMSCs中MAGE-D1的表达上调β-catenin,下调E-cadherin,能够提高细胞的迁移能力,但是其导致增殖能力降低,MAGE-D1可能作为EMSCs迁移增殖能力的关键因子。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
外胚间充质干细胞论文参考文献
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