文远蓉1李轶2何毅1万里科1李书平1刘胡敏1张杰1谢石全1
（1成都市血液中心四川成都610041）
（2成都医学院四川成都610083）
【摘要】目的：探讨ELISA两步法全面实施后献血者HBsAg阳性淘汰率升高的原因。方法：对成都市血液中心2005年至2011年献血者血液标本进行HBsAg检测，比较阳性淘汰率变化趋势，分析新投入使用的两步法HBsAg试剂的灵敏度和特异性。结果：ELISA两步法全面实施后HBsAg阳性淘汰率上升约0.7%，新投入使用的两步法试剂检测室内质控品的S/CO值均比一步法试剂结果高。结论：两步法ELISAHBsAg试剂提高了检测灵敏度，但对其特异性也应达到较高的水平。
【关键词】两步法献血者HBsAg
【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）12-0107-02
乙型肝炎是通过与血液接触有关的危险行为进行传播的[1]，乙型肝炎感染献血者对血液安全构成直接的威胁。中国一直都是一个乙肝大国，因此对献血者HBsAg的检测显得尤为重要。ELISA法是目前HBsAg检测的主要方法，而ELISA两步法相对于一步法而言，由于消除了钩状效应，在一定程度上降低了HBsAg检测的漏检率，HBsAg淘汰率肯定有一定的上升，但检测方法改进所引起的阳性率升高应该在一个合理的范围。而ELISA两步法全面实施后献血者HBsAg检测阳性淘汰率如果出现异常升高，就应该分析所使用试剂的特异性是否符合工作要求。为此对产生这种现象的原因进行分析。
1对象与方法1.1对象
2005年01月至2011年12月期间，对成都地区献血者的血液样品进行检验，选择HBsAg检测结果为阳性的献血者作为研究对象。
1.2方法
1.2.1试剂及设备HBsAg检测设备：KUBOTA8410和8420型离心机（日本KUBOTA公司）；AT+2全自动加样器、STAR全自动加样器和FAME全自动酶免分析仪（瑞士HAMILTON公司）。试剂：乙型肝炎病毒表面诊断试剂盒（1：国产试剂盒A、国产试剂盒B、国产试剂盒C，2：进口试剂盒（MurexBiotechLimited）。质控品：0.2IU/ml和0.5IU/ml（卫生部临检中心）
1.2.2检验方法进口试剂MurexHBsAgVersion3一直采用两步法检测HBsAg。国产乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒2011年7月以前采用一步法，2011年7月后采用两步法，试剂均为A厂家。
1.2.3判定标准国产与进口试剂同时进行检测，如任一试剂出现阳性，则双孔复查，复查后两孔阴性结果判断为阴性，否则判为阳性。
1.2.4不同方法对低值质控品检测结果的比较用一步法对0.5IU/ml、两步法对0.2IU/ml的质控品分别进行检测，并对其S/CO结果进行比较。
1.2.5国产两步法试剂结果比对抽取MurexHBsAgVersion3检测结果为阴性而使用国产两步法A试剂检测结果为阳性的血液标本，用两步法A试剂、B试剂以及C试剂同时检测。对三种国产试剂的检测结果进行比较。
2结果
2.12005-2010年间因HBsAg检测阳性而淘汰的血液产品比例基本保持平稳，2011年淘汰率突然明显升高，见表1。
表12005-2011年HBsAg检测阳性结果
2.22011年7月因使用国产A两步法试剂，HBsAg检测阳性淘汰率比例突然明显持续的升高，见表2。
表22011年1-12月HBsAg检测阳性结果
2.32011年1-6月采用一步法和2011年7-12月采用两步法后质控品S/CO结果比较,采用两步法后试剂的灵敏度明显提高。见表3。
表3国产A试剂一步法和两步法检测质控品S/CO结果比较
2.4选取HBsAg（进口MurexVersion3）试剂检测结果为阴性，A试剂检测结果为阳性的血液标本，再用A、B以及C三种国产试剂检测，A试剂特异性最低，见表4。
表4A试剂、B试剂及C试剂检测18份血液标本的结果比较
3讨论
乙型肝炎的流行率在我国处于下降趋势，其感染率已从10%降低到7.18%[2]。乙型肝炎流行率与献血者HBsAg阳性率有一定的关系，因此，在没有发生大的公共卫生事件且我们的招募对象也没有发生明显变化的情况下，献血者乙肝阳性率变化应该不会太大。但是本次调查结果表明2005-2010年期间献血者HBsAg阳性率一直处于平稳的状态（1.1%左右），然而2011年7月以后阳性检出率突然上升到1.7%。为此笔者对产生这种现象的原因进行了分析。
ELISA一步法与两步法均是目前检验科常用的免疫学检测方法，其基本步骤包括包被抗体(抗原)，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)一待测抗体(抗原)一酶标记抗体的复合物，加入底物，底物被酶催化后生成有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析[3]。一步法与两步法主要区别在于一步法测定体系中同时加入待测标本和酶标抗体，酶标抗体与包被抗体会同时竞争抗原，当抗原过量时，会出现高剂量钩状效应，导致结果偏低甚至出现假阴性结果。而两步法在标本(待测抗原)与包被固相抗体反应后需孵育、洗涤，将未被结合的待测抗体洗掉后再加入酶标记抗原，从而可以避免“钩状效应”的发生[4]。因此，采供血机构应用两步法试剂对献血者血液进行检测可以降低漏检率[5]，对血液的安全保障具有肯定性意义。
夹心法测定是采用一步还是两步，其对测定的影响主要是实验的测定下限、特异性和简便性[6]。按卫生部要求2011年7月后血站HBsAg检测均开始采用两步法[7]。由于方法学的改变，国产试剂检测结果灵敏度有所提高。使用一步法国产试剂品牌A时，浓度为0.5IU/ml的质控品S/CO比值为3.755，改用两步法后浓度为0.2IU/ml的质控品S/CO比值为13.89，见表3，表明检测灵敏度显著提高。随着灵敏度的提高，献血者HBsAg淘汰率同时出现较大幅度升高，2011年1.1-7.22间检测总样本量为81960，检出841个HBsAg阳性标本，阳性率为1.0260；而7.23-12.31间检测总样本量为76648，检出939个阳性标本，阳性率为1.725，见表2。
鉴于两步法进口试剂已经经过长时间的验证，结果相对可靠。应考虑新投入使用的国产试剂A的特异性是否存在问题。因此有必要对试剂A检测阳性而进口试剂试验结果为阴性的标本进行确认实验。但是由于资源有限，这些标本没有进行确认实验。因此笔者使用多种试剂对比的方法对试剂A的特异性进行试验分析，对检测结果的准确性作初步的判断。
选择用进口试剂确认检测结果为阴性并且用国产试剂盒A检测阳性的18份标本，再用国产试剂盒B和C同时进行检测，结果试剂盒A检测出的18个阳性样本，B和C仅检出一份阳性且为同一个标本，见表4，其余17个样本均为阴性。通过比较：可以判定A试剂的检测结果为假阳性。因此HBsAg阳性率的增高并非方法学改变所致，而是由于试剂A特异性较差造成。很多合格献血者在规定的献血间隔会再次献血，是献血者队伍中的重要组成部分。但是献血者捐献的血液一旦被判定为HBsAg阳性，目前的软件系统会将其列入终身将不能献血的名单中，造成不必要的献血者流失，同时也可能带给部分献血者一定的心理负担。所以生产厂家在提高试剂灵敏度的同时须进一步提高特异性，这样才能降低假阳性的比率，减少血液资源浪费。
HBsAg两步法试剂对HBsAg检测阳性淘汰率的影响还需要进一步的观察与研究。为了保证血液的安全，血站在选择试剂时首先考虑的是高灵敏度，其次为高特异性[8]。但在保证高灵敏度的同时如何减少血液假阳性的产生，避免血液资源的浪费，是一个值得关注的问题，应当引起高度重视。
参考文献
[1]何毅,田莉，吕鹤年.公共卫生状况的变化与献血者的筛选[J].中国输血杂志，2004，17（6）：472-273.
[2]我国乙肝免疫预防获成效表面抗原携带率为7.18%[EB/OL].http://www.china.com.cn/news/2008-04/21/content_14986303.htm,2008-04-21.
[3]王伟.ELISA检测乙肝标志物的影响因素浅析[J].黑龙江医药，2010,23(5)：819-820.
[4]劳丽嫦.酶联免疫吸附试验两步法在HIV抗体检测中的应用[J].医学信息，2009，6（22）：948-949.
[5]贾保林.ELISA一步法对高浓度HBsAg的影响分析[J].中华现代临床医学杂志，2011,9(3).
[6]李金明.临床免疫测定技术[M].北京：人民军医出版社，2006：121
[7]卫生部血站实验室管理规范[S]卫医发［2006］183号：9
[8]夏传友于艳涛李交等.两步法ELISA试剂评估结果的比较[J].国际医药卫生导报,2011,11(17)：1378-1380