百子莲Y2SK2与SK3脱水素逆境保护生理功能研究

论文摘要

脱水素与植物对水分胁迫的响应紧密相关。前期研究发现,百子莲（Agapanthus praecox）脱水素ApY2SK2与ApSK3在百子莲胚性愈伤的超低温保存过程中积极响应复合逆境,并获得二者的全长cDNA和编码蛋白序列。本文通过体内与体外实验进一步揭示百子莲脱水素ApY2SK2与ApSK3的逆境保护功能。对野生型和ApY2SK2,ApSK3过表达拟南芥不同胁迫处理后的形态指标的观测结果表明,转基因拟南芥植株的抗逆性相对于野生型明显提升,其在逆境下的单株鲜重、莲座大小和根长均能高于野生型。生理指标检测结果显示,相对于野生型,ApY2SK2与ApSK3过表达植株在盐、渗透、低温和干旱胁迫下,表现出膜脂过氧化程度和ROS水平的降低,抗氧化活性、脯氨酸含量和光合能力的提升。ApY2SK2与ApSK3同时能够提升大肠杆菌在各种胁迫下的存活率,并且ApY2SK2能更有效的提升植物和原核细胞的抗逆能力。亚细胞定位结果表明,ApY2SK2与ApSK3均能定位于细胞质和细胞膜,ApY2SK2同时可定位于细胞核。采用pET21a载体与Transetta（DE3）大肠杆菌进行蛋白原核表达,ApY2SK2-His最佳诱导条件为1.01.5 mM IPTG,35°C下诱导56h;ApSK3-His最佳诱导条件为0.20.5 mM IPTG,25°C下诱导56h。蛋白纯化方式的简化实验表明,可采用菌液煮沸裂解的方式快速纯化富集无His标签的ApY2SK2和ApSK3蛋白以应用于体外实验,并验证了脱水素蛋白的热稳定性。体外实验结果表明,ApY2SK2和ApSK3在冻融过程中均能有效保护LDH酶活性,ApY2SK2同时能够在脱水过程中保护酶活性;体外ROS清除实验表明ApY2SK2和ApSK3均能显著抑制Fenton反应中羟自由基的产生;IMAC实验表明ApY2SK2和ApSK3脱水素蛋白能够结合金属离子,亲和力顺序为Co2+>Ni2+>Cu2+>Fe3+,且ApSK3具有较强的金属离子结合和ROS清除功能。超低温实验表明,ApY2SK2和ApSK3转基因拟南芥幼苗处理后的存活率为47%和55%,显著高于野生型幼苗的存活率23%;同时,在植物玻璃化溶液中添加纯化的ApY2SK2和ApSK3蛋白后能够将野生型拟南芥的存活率提升至50%和46%。本研究证明,ApY2SK2和ApSK3能有效地提高细胞对胁迫的耐受能力,并在体内与体外的多个方面具有应用潜力。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 植物抗逆生理概述
•   1.2 脱水素蛋白的结构与特征
•     1.2.1 脱水素蛋白基本特性
•     1.2.2 脱水素蛋白结构与分类
•   1.3 脱水素蛋白逆境保护功能概述
•     1.3.1 脱水素蛋白对质膜的保护作用
•     1.3.2 脱水素蛋白对蛋白和酶活性的保护作用
•     1.3.3 脱水素蛋白的离子结合和ROS组分清除能力
•     1.3.4 脱水素蛋白的冰晶抑制与低温保护能力
•   1.4 植物超低温保存中逆境响应研究进展
•   1.5 研究目的与意义
•   1.6 主要研究内容与研究思路
•     1.6.1 主要研究内容
•     1.6.2 技术路线图
• 第二章 ApY2SK2与Ap SK3脱水素蛋白体内功能研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 主要实验试剂与仪器
•     2.1.3 实验方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 转基因拟南芥株系筛选与初步表型观察
•     2.2.2 转基因拟南芥中目的基因与蛋白的表达
•     2.2.3 不同逆境处理下拟南芥表型与形态指标差异
•     2.2.4 不同逆境处理下拟南芥膜脂过氧化程度差异
•     2.2.5 不同逆境处理下拟南芥中ROS组分差异
•     2.2.6 不同逆境处理下拟南芥中抗氧化系统活性差异
•     2.2.7 不同逆境处理下拟南芥中脯氨酸含量差异
•     2.2.8 不同逆境处理下拟南芥光合作用能力差异
•     2.2.9 不同逆境处理下拟南芥抗氧化系统指标相关性分析
•     2.2.10 ApY2SK2和ApSK3对拟南芥幼苗超低温保存成活率的影响
•     2.2.11 ApY2SK2与ApSK3蛋白亚细胞定位
•   2.3 讨论
•   2.4 本章小结
• 第三章 ApY2SK2和Ap SK3脱水素蛋白原核表达与体外功能验证
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 主要仪器与药品
•     3.1.2 实验方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 ApDHNs-His蛋白的原核表达与纯化富集
•     3.2.2 ApDHNs蛋白的原核表达与纯化富集
•     3.2.3 ApDHNs对大肠杆菌抗逆能力的影响
•     3.2.4 ApDHNs对 LDH酶活性的保护作用
•     3.2.5 ApDHNs对体外ROS生成的抑制效果
•     3.2.6 ApDHNs与金属离子的结合能力分析
•     3.2.7 ApDHNs对拟南芥超低温保存恢复生长率的影响
•   3.3 讨论
•   3.4 本章小结
• 第四章 结论与展望
•   4.1 主要结论
•   4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨舟

导师: 张荻

关键词: 脱水素,非生物胁迫,活性氧,蛋白功能,百子莲

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q945.78

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.003233

总页数: 96

文件大小: 6466K

下载量: 23