基孔肯雅热E2蛋白原核表达、纯化及不同佐剂的免疫效果评价

论文摘要

目的:实现CHIKV-E2蛋白的原核表达、纯化以及复性,然后将不同佐剂对亚单位疫苗免疫增强作用进行比较,从而筛选出协同亚单位疫苗具有良好免疫原性的佐剂,为后续的CHIKV亚单位疫苗的开发奠定基础。方法:（1）根据Genbank公布的CHIKV-E2序列合成E2基因,通过PCR与胶回收获得E2基因,插入pEASY-Bluent Zero克隆载体,测序正确后双酶切回收E2基因片段,而后连接双酶切后的pET-28a载体,获得重组质粒并进行双酶切鉴定。（2）将重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达,并优化诱导条件（时间、温度、IPTG浓度）,大量表达重组蛋白后进行Ni柱亲和层析从而获得纯度较高的目的蛋白,而后纯化后的蛋白进行透析复性获得可溶性蛋白,并进行WB验证。（3）将获得的可溶性E2蛋白辅以不同的佐剂共同免疫小鼠,每周均采集小鼠血液并分离血清,并对血清做以下5种指标的检测,分别为T淋巴细胞增殖的检测、T淋巴细胞亚群的检测、细胞因子IL-4、IFN-γ的检测、特异性抗体的检测。结果:（1）成功构建了pET28a-E2重组质粒,实现了E2蛋白的原核表达,并最终确定最佳诱导条件为:温度为37℃、时间为6h、IPTG的浓度为0.3mM。采用Ni柱亲和层析法来纯化E2蛋白,最终得到纯度为90%、浓度为0.54mg/mL的目的蛋白溶液,通过透析复性梯度降低尿素的浓度,最终得到了可溶性蛋白,测得其浓度为0.23mg/mL。（2）含有佐剂的亚单位疫苗免疫效果均好于不含佐剂组亚单位疫苗,说明佐剂能提高亚单位疫苗的免疫原性,其中E2+佐剂（A+D）组和E2+佐剂（B+E）组在细胞免疫和体液免疫中均有良好的效果,所以佐剂（A+D）组合和佐剂（B+E）组合可作为CHIKV-E2亚单位疫苗开发中的候选佐剂。结论:成功实现了CHIKV-E2蛋白的原核表达、纯化以及复性,得到了纯度较高的可溶性蛋白,通过小鼠免疫实验成功筛选出两组佐剂分别为佐剂（A+D）组合和佐剂（B+E）组合,可作为CHIKV-E2亚单位疫苗开发中的候选佐剂。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 前言
• 文献综述
•   1 基孔肯雅病毒
•     1.1 病原学特征
•     1.2 临床症状
•     1.3 流行病学
•     1.4 诊断与治疗
•     1.5 感染CHIKV产生的免疫反应
•   2 基孔肯雅热疫苗研究进展
•     2.1 减毒活疫苗
•     2.2 灭活疫苗
•     2.3 亚单位疫苗
•     2.4 病毒样颗粒疫苗（VLP）
•     2.5 DNA疫苗
•     2.6 嵌合疫苗
•   3 疫苗佐剂
•     3.1 铝盐佐剂
•     3.2 乳化佐剂
•     3.3 脂质粒子佐剂
•     3.4 聚合粒子佐剂
• 第一章 基孔肯雅热E2蛋白的原核表达与纯化
•   1.1 实验材料
•     1.1.1 菌种、质粒、基因及引物
•     1.1.2 主要试剂及主要试剂盒
•     1.1.3 主要仪器
•     1.1.4 常用溶液及培养基的配制
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 目的基因获取及引物设计
•     1.2.2 目的基因CHIKV E2 的扩增以及目的片段的回收
•     1.2.3 连接
•     1.2.4 连接产物的转化与重组质粒的小量提取
•     1.2.5 pEASY-Bluent Zero-E2和pET-28a载体的双酶切和连接
•     1.2.6 连接产物转化至感受态细胞感受态细胞trans5α
•     1.2.7 重组质粒pET28a-E2 的酶切鉴定
•     1.2.8 重组质粒pET28a-E2 的诱导表达
•     1.2.9 表达条件的优化
•     1.2.10 重组蛋白的纯化
•     1.2.11 蛋白的复性
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 CHIKV-E2 基因PCR扩增结果
•     1.3.2 pEASY-Bluent Zero-E2 质粒的双酶切鉴定
•     1.3.3 重组质粒pET28a-E2 双酶切鉴定结果
•     1.3.4 CHIKV E2 蛋白表达产物的鉴定
•     1.3.5 诱导条件的优化
•     1.3.6 蛋白纯化结果
•     1.3.7 蛋白复性结果
•   1.4 讨论
•   1.5 小结
• 第二章 不同佐剂对亚单位疫苗免疫增强作用的比较
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物与毒株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要器材与耗材
•     2.1.4 主要试剂的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 动物实验各成分的配制及用量
•     2.2.2 动物实验分组
•     2.2.3 特异性抗体的检测
•     2.2.4 小鼠淋巴细胞的分离
•     2.2.5淋巴细胞增殖实验
•     2.2.6 T淋巴细胞亚群检测
•     2.2.7 细胞因子的检测
•     2.2.8 统计学方法
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 T淋巴细胞的亚群检测
•     2.3.2 淋巴细胞增殖实验
•     2.3.3 细胞因子IL-4 的检测结果
•     2.3.4 细胞因子IFN-γ的检测结果
•     2.3.5 特异性抗体的检测结果
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭丹丹

导师: 郭焱

关键词: 基孔肯雅热,重组蛋白,纯化,佐剂

来源: 长春中医药大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 长春中医药大学

分类号: R392

DOI: 10.26980/d.cnki.gcczc.2019.000337

总页数: 66

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