论文摘要
Henry反应是有机反应中形成C-C键的重要反应,该反应以硝基烷烃与醛或酮类为底物生成β-硝基醇类化合物。使用金属络合物等化学催化剂催化Henry反应存在反应条件苛刻、副反应多,污染大等弊端。而利用脂肪酶的催化功能多样性进行酶促Henry反应可以有效解决上述问题。目前,已发现少数几种脂肪酶具有催化Henry反应的能力,但反应活性及选择性均较差,且没有关于酶结构改造及催化机理解析的报道。因此本文对脂肪酶催化的Henry反应进行研究,从酶的筛选、纯酶的表达、催化机理的解析以及化学修饰改造等方面展开。首先,以苯甲醛与硝基甲烷为模式反应,对一系列常见的商品化脂肪酶进行筛选,获得反应活性较优的脂肪酶RNL,其在纯水体系中的产品产率为36.10%。对RNL进行蛋白电泳后发现,其目标蛋白纯度较低,杂蛋白含量多。因此选择毕赤酵母GS115作为载体,进行表达纯化。收获纯酶后,继续对该酶的基本酶学性质进行研究:RNL的最适温度为40℃,最适pH为8.0,在45℃环境中放置2 h后残余酶活仍达70%以上。接着,对RNL催化Henry反应的催化机理进行探究。首先,借助分子对接,发现活性中心附近10 A范围内存在五个氨基酸残基:Ser81、Phe82、Ile86、Ser145以及His257,可能参与了反应。随后,借助分子动力学模拟,对这些氨基酸位点在反应中的作用进行探究,发现催化三联体中的Ser145及His257通过与底物形成氢键,起到质子传递作用,是影响反应活性的关键氨基酸位点。Ser81、Phe82、Ile86通过与两底物形成弱键作用力,对底物进行“锚定”。并以此模拟结果为基础进行单点突变验证,对脂肪酶催化Henry反应的催化机理进行了初步解析。最后,为了进一步提高RNL的反应活性,使用化学修饰法对RNL酶的分子结构进行改造。结果表明,当RNL上的Arg残基被1,2-环己二酮（CHD）修饰后,产品产率提高1.4倍。接着通过对反应条件进行优化,得到了较优的反应条件:苯甲醛0.1 mmol;硝基甲烷2.5 mmol;pH 7.5磷酸缓冲液1 mL;RNL（CHD）修饰酶10 mg;35℃恒温搅拌反应24 h,使产品产率进一步由48.15%提升至66.70%。随后,对该反应适用的底物范围进行考察,发现RNL可催化一系列芳香醛与硝基烷烃发生反应,且均取得较好的收率,其中以对硝基苯甲醛为底物时产率最高,达99.43%。
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致谢摘要Abstract第一章 文献综述 1.1 酶的催化功能多样性 1.1.1 概述 1.1.2 酶的催化功能多样性的研究进展 1.2 Henry反应 1.2.1 Henry反应简介 1.2.2 Henry反应研究进展 1.3 脂肪酶及其研究背景 1.3.1 脂肪酶简介 1.3.2 脂肪酶的结构特点 1.3.3 脂肪酶的催化机理 1.3.4 脂肪酶的化学修饰 1.4 分子模拟 1.4.1 分子模拟方法 1.4.2 分子模拟在脂肪酶研究中的应用 1.5 本文的研究思路及主要内容第二章 Henry反应活性脂肪酶的筛选及表达纯化 2.1 引言 2.2 实验材料与设备 2.2.1 商品化脂肪酶 2.2.2 实验试剂与药品 2.2.3 菌种与质粒 2.2.4 试剂配制 2.2.5 培养基配置 2.2.6 实验仪器与设备 2.3 实验方法 2.3.1 脂肪酶筛选条件 2.3.2 产物的检测及分析 2.3.3 基因来源与测序 2.3.4 重组表达质粒的构建与大肠杆菌的转化 2.3.5 线性化质粒准备 2.3.6 感受态毕赤酵母的制备 2.3.7 毕赤酵母的电转及筛选 2.3.8 毕赤酵母重组菌的验证 2.3.9 重组毕赤酵母的诱导表达 2.3.10 重组酶的分离纯化 2.3.11 SDS-PAGE蛋白电泳 2.3.12 蛋白浓度测定 2.3.13 酶活测定方法 2.3.14 重组脂肪酶RNL酶学性质探究 2.4 结果与讨论 2.4.1 Henry反应商品酶初筛结果 2.4.2 pPIC9K-RNL重组质粒的构建结果 2.4.3 毕赤酵母电转结果 2.4.4 RNL的异源表达及纯化结果 2.4.5 RNL（纯酶）Henry反应结果 2.4.6 RNL酶学性质研究结果 2.5 本章小结第三章 RNL酶促Henry反应的机理探究 3.1 引言 3.2 实验方法 3.2.1 受体蛋白准备 3.2.2 配体对硝基苯甲醛与硝基甲烷的准备 3.2.3 配体与脂肪酶对接 3.2.4 建立小分子配体的电荷与电场参数 3.2.5 建立非标准氨基酸Ser145的力场参数 3.2.6 分子动力学计算 3.2.7 RNL突变菌的构建 3.2.8 RNL突变酶的表达与纯化 3.2.9 RNL突变酶的Henry反应 3.3 结果与讨论 3.3.1 RNL与β-硝基醇的分子对接结果 3.3.2 RNL的分子动力学结果 3.3.3 S145A及H257A突变体的构建结果 3.3.4 S145A及H257A突变酶的表达及纯化结果 3.3.5 RNL-S145A及RNL-H257A的Henry反应结果 3.4 本章小结第四章 脂肪酶RNL的化学修饰及催化Henry反应研究 4.1 引言 4.2 实验材料与设备 4.3 实验方法 4.3.1 RNL的化学修饰 4.3.2 RNL （CHD）修饰酶的失活动力学 4.3.3 β-硝基醇的制备 4.3.4 RNL修饰酶的Henry反应体系 4.4 结果与讨论 4.4.1 RNL化学修饰结果 4.4.2 最适反应温度确定 4.4.3 最适反应pH确定 4.4.4 最适底物比确定 4.4.5 最适酶添加量确定 4.4.6 最适反应时间确定 4.4.7 底物谱探究 4.5 本章小结第五章 结论与展望 5.1 结论 5.2 展望参考文献附录Ⅰ RNL的原始基因序列及密码子优化序列1H NMR和13C NMR的核磁谱图'>附录Ⅱ β-硝基醇的1H NMR和13C NMR的核磁谱图作者简介
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张倩
导师: 徐刚
关键词: 酶的催化功能多样性,脂肪酶,反应,化学修饰,分子模拟
来源: 浙江大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 浙江大学
分类号: Q55
DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.000813
总页数: 90
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标签：酶的催化功能多样性论文; 脂肪酶论文; 反应论文; 化学修饰论文; 分子模拟论文;
