慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化

论文摘要

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶（MAT）在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAMe）。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列（AccessionNo.NM001167650.1）和MAT2B基因序列（AccessionNo.NM001142832.1）,获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I （TaKaRa）双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒（CMV-Δ8.9和CMV-VSVG）共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白（GFP）,表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平（P<0.01）;干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平（P<0.05）。油红O染色和吸光度定量结果显示,与sh-scramble对照组相比,干扰MAT2A和MAT2B基因后,脂滴聚积能力显著抑制猪肌内脂肪细胞脂质积累。实时定量结果显示,干扰MAT2A和MAT2B基因抑制成脂标志基因PPARγ,aP 2及CEBP/α的表达。【结论】成功构建了猪MAT2A和MAT2B基因的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B干扰载体。获得的重组慢病毒感染细胞后,能有效降低猪肌内前体脂肪细胞内MAT2A和MAT2B基因的m RNA和蛋白水平表达;进一步试验证明,干扰MAT2A及MAT2B基因后,显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质积累以及成脂关键基因表达。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 猪肌内脂肪细胞分离培养
•     1.2.2 猪pLentiH1-MAT2A/2B shRNA慢病毒重组质粒构建与鉴定
•     1.2.3 重组慢病毒p Lenti H1-MAT2A/2B shRNA包装、浓缩及滴度测定
•     1.2.4 油红O染色与定量分析
•     1.2.5 RNA提取和Real-time PCR定量分析
•     1.2.6 蛋白提取及Western blot印迹分析
•   1.3 统计分析
• 2 结果
•   2.1 MAT2A/2B重组慢病毒干扰载体的构建与鉴定
•   2.2 p LentiHl-MAT2A/2B慢病毒干扰载体的包装和滴度测定
•   2.3 pLentiHl-MAT2A/2B shRNA侵染猪肌内前体脂肪细胞效果
•   2.4 干扰MAT2A和MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 赵存真,易本驰,陈培荣,李建柱,赵云焕,朱忠珂

关键词: 腺苷甲硫氨酸转移酶,慢病毒,肌内脂肪细胞

来源: 中国农业科学 2019年15期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 信阳农林学院牧医工程学院

基金: 国家自然科学基金(31702096),河南省教育厅项目(18B230010),信阳农林学院校级科技创新团队(CXTD-201701)

分类号: S828;Q78

页码: 2706-2715

总页数: 10

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