牛坏死杆菌43 kDa OMP黏附BHK-21细胞受体蛋白的初步筛选

论文摘要

坏死杆菌（Fusobacterium necrophorum）是一种革兰氏阴性非芽孢专性厌氧多形性细菌,是人类和动物消化道的常在菌。坏死杆菌的发病机制中最重要的因素之一是细菌与宿主细胞的黏附。细菌与宿主细胞的黏附有助于它寄居于宿主组织细胞上,进而在细胞内繁殖并扩散到其他组织。虽然已有研究表明牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白（Outer membrane protein,OMP）能与仓鼠肾细胞、牛子宫内膜细胞及牛乳腺上皮细胞黏附,但具体是宿主细胞的哪种蛋白或哪一系列蛋白能与之作用还不清楚,因此本试验对牛坏死杆菌43 kDa OMP与BHK-21细胞的相互作用蛋白进行了初步筛选。本试验构建了pCAGGS-43 kDa OMP的真核表达载体,经鉴定后转化至大肠杆菌细胞中进行质粒提取,将提取的重组质粒转染至BHK-21细胞进行瞬时表达,之后制备牛坏死杆菌43 kDa OMP的单克隆抗体,采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价,并进行亚型鉴定、Western blot鉴定及间接免疫荧光鉴定,最后利用制备好的43 kDa OMP的单克隆抗体通过免疫共沉淀初步筛选牛坏死杆菌43 kDa OMP与BHK-21细胞相互作用的蛋白。结果如下:（1）牛坏死杆菌43 kDa OMP在BHK-21细胞中瞬时表达;（2）成功制备了1株牛坏死杆菌43 kDa OMP单克隆抗体并命名为O43;（3）通过免疫共沉淀方法初步筛选出的差异性条带,进行质谱分析结果检测出70个疑似差异蛋白。本试验初步筛选牛坏死杆菌43 kDa OMP与BHK-21细胞相互作用的蛋白,为探讨牛坏死杆菌43 kDa OMP与牛宿主细胞相互作用的蛋白提供理论依据,对深入研究坏死杆菌的发病机制提供了更多的参考,对牛坏死杆菌的抗菌药物设计研究提供新的理论基础。

论文目录

• 中英文对照缩略表
• 摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
•   1.1 坏死杆菌概述
•   1.2 坏死杆菌致病机制
•     1.2.1 毒力因子
•     1.2.2 协同作用
•   1.3 预防和治疗
•   1.4 目的意义
• 2 牛坏死杆菌43 kDa OMP质粒在BHK-21细胞中的瞬时表达
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞及主要试剂
•     2.1.2 主要仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 重组质粒合成及引物设计
•     2.2.2 重组质粒的鉴定
•     2.2.3 重组质粒的大量提取
•     2.2.4 BHK-21细胞培养
•     2.2.5 转染
•     2.2.6 重组质粒表达的Western blot鉴定
•   2.3 结果
•     2.3.1 重组质粒鉴定结果
•     2.3.2 重组质粒Western blot鉴定结果
•   2.4 讨论
• 3 牛坏死杆菌43 kDa OMP单克隆抗体的制备
•   3.1 材料
•     3.1.1 细胞、实验动物及主要试剂
•     3.1.2 主要仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 单克隆抗体的制备
•     3.2.2 单克隆抗体的鉴定
•   3.3 结果
•     3.3.1 间接ELISA检测方法的建立
•     3.3.2 杂交瘤细胞株的筛选和克隆
•     3.3.3 单克隆抗体的效价测定
•     3.3.4 单克隆抗体亚类的鉴定
•     3.3.5 单克隆抗体的Western blot鉴定
•     3.3.6 间接免疫荧光试验
•   3.4 讨论
• 4 牛坏死杆菌43 kDa OMP与BHK-21细胞互作蛋白的初步筛选
•   4.1 材料
•     4.1.1 细胞及主要试剂
•     4.1.2 主要仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 BHK-21细胞培养
•     4.2.2 细胞总蛋白的提取
•     4.2.3 琼脂糖珠去除非特异性杂蛋白
•     4.2.4 BCA法测蛋白浓度
•     4.2.5 免疫共沉淀
•     4.2.6 SDS-PAGE凝胶电泳
•     4.2.7 质谱分析
•   4.3 结果
•     4.3.1 免疫共沉淀
•     4.3.2 质谱分析
•   4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张思瑶

导师: 郭东华

关键词: 牛坏死杆菌,外膜蛋白,单克隆抗体,蛋白互作

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

基金: 国家自然科学基金项目(31572534)

分类号: S852.61

总页数: 70

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