拟南芥糖基转移酶基因UGT73C4参与抗病的作用分析

论文摘要

自然界中的病源微生物无处不在,它们通过不同的途径进入植物体内,寄宿在植物体细胞间,导致植物产生病害。糖基转移酶是一类负责糖基化修饰的酶,它能将糖基从供体转移到受体分子上,从而改变受体分子的稳定性、水溶性等,进而对植物生长发育和适应环境中起着重要作用。根据公开获得的芯片数据和发表的文献得知,拟南芥糖基转移酶基因UGT73C4受病原菌和水杨酸(SA)诱导上调表达,这暗示着UGT73C4基因可能参与拟南芥的生物胁迫。为了明确糖基转移酶UGT73C4的生物学功能,开展了本课题研究。首先用病原细菌Pst DC3000处理两周龄的野生型拟南芥,并用实时荧光定量PCR技术检测了UGT73C 基因在病原细菌处理不同时间后的表达水平。结果显示,UGT73C4受病原菌诱导上调表达,且在24h上调最为明显。同时,又用病原细菌Pst DC3000处理由UGT73C4启动子驱动GUS基因表达的转基因株系,发现在病原细菌处理后,转基因植物叶片组织的GUS染色显著加深。另外,还检测到UGT73C4基因受SA诱导表达。这些结果说明糖基转移酶基因UGT73C4受病原细菌Pst DC3000和SA诱导表达,可能参与植物的抗病反应。在获得了UGT73C4基因的过表达株系和敲除株系材料后,我们用Pst DC3000分别注射UGT73C4的敲除株系、过表达株系和野生型株系,发现UGT73C4过表达株系的病菌数量显著少于野生型和突变体株系,证明糖基化转移酶UGT73C4参与植物抗病反应,同时利用烟草瞬时转化实验也进一步证明了糖基转移酶UGT73C4参与植物免疫反应。在此基础上,进一步探索了UGT73C4基因在植物应对生物胁迫中的作用机制。通过DAB和NBT等组织化学染色实验发现UGT73C4过表达株系有明显的活性氧积累,通过qPCR检测发现与SA信号途径有关的PRl、PR2等抗病响应基因在过表达株系中明显上调,推测UGT73C4可能是通过SA途径参与植物抗病的。进一步检测了SA合成相关基因或者SA合成调节基因,发现在病原细菌处理后,UGT73C4过表达株系中EDS1、PAD4、ICS7等基因表达水平均显著高于突变株系和野生型拟南芥。通过高效液相色谱结合质谱技术分析检测了病原细菌处理后24h的不同基因型株系中SA的含量,发现不论是自由态的SA还是总SA含量,在过表达株系中均明显高于野生型和突变体植株。证明糖基转移酶UGT73C4是通过SA的积累,进而增强植物的抗病性。本研究还发现糖基转移酶基因UGT73C4受土壤病原真菌Foc699诱导表达上调。我们用带GFP标签的Foc699菌株处理UGT73C4的敲除株系、过表达株系和野生拟南芥,通过荧光显微镜发现过表达株系根上的真菌Foc699荧光含量明显少于突变体和野生型。在病原真菌Foc699侵染各基因型株系的根部并转入土壤继续培养,发现过表达株系长势明显好于突变体和野生型株系,说明糖基转移酶UGT73C4能够提高植物地下部分对土传病原菌的抗性。同时,发现过表达株系在根中与茉莉酸(JA)和抗真菌相关的标志基因上调表达,反映出UGT73C4导致的植物根系抗病可能涉及到JA信号途径。本研究还构建了UGT73C4基因的原核表达载体,纯化了在细菌中表达的糖基转移酶UGT73C4,对植物的某些天然代谢物进行了酶活性分析,但目前尚未确定该糖基转移酶的作用底物。总之,本论文通过对UGT73C4基因的突变体和过表达体的一系类研究,明确了糖基转移酶UGT73C4在植物地上部和地下部抗病响应中发挥着重要作用,初步说明UGT73C4导致的抗病响应可能与SA以及JA信号途径有关。但是更深层的抗病机理还需要进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 一 前言
•   1 植物糖基转移酶与糖基化修饰
•     1.1 糖基转移酶的定义、分类和特点
•     1.2 糖基转移酶的生物学功能
•     1.3 糖基转移酶的未来应用
•   2 植物的免疫反应
•     2.1 植物免疫的分类与特点
•     2.2 微生物识别模式触发的免疫反应
•     2.3 效应蛋白触发的免疫反应
•     2.4 植物免疫与SA的关系
•   3 本研究的目的和意义
•     3.1 植物抗病研究的理论意义和实际意义
•     3.2 本课题的立题依据和研究内容
• 二 材料与方法
•   1 实验材料
•     1.1 植物材料
•     1.2 载体与菌株
•     1.3 主要试剂和药品
•     1.4 主要培养基
•     1.5 主要溶液配方
•   2 实验方法
•     2.1 植物材料种植
•     2.2 植物过表达载体构建及转基因植株的获得
•     2.3 CRISPR/Cas9基因敲除载体构建及转基因植株的获得
•     2.4 T-DNA插入体的鉴定和获得
•     2.5 原核表达载体的构建及蛋白纯化和体外酶促反应
•     2.6 植物GUS报告载体的构建及转基因植株的获得
•     2.7 病原细菌Pst DC3000诱导分析
•     2.8 转基因植物抗病表型分析
•     2.9 转基因植物抗病相关生理指标分析测定
•     2.10 Foc699-GFP感染实验
•     2.11 实验数据的统计学处理
• 三 结果与分析
•   1 拟南芥UGT73C4基因表达特异性研究
•     1.1 病原细菌侵染和SA处理对UGT73C4基因的诱导表达分析
•     1.2 UGT73C4启动子驱动GUS表达的转基因植株的获得与表达分析
•   2 UGT73C4过表达体和突变体植株的获得与鉴定
•     2.1 UGT73C4过表达植株的制备
•     2.2 UGT73C4过表达株系中基因表达水平的鉴定
•     2.3 UGT73C4 CRISPR/Cas9载体的构建和突变体株系的获得
•     2.4 UGT73C4的T-DNA插入突变体的鉴定与获得
•   3 UGT73C4基因在植物抵御病原菌侵害中的作用
•     3.1 UGT73C4突变体和过表达体的抗病性
•     3.2 UGT73C4突变体和过表达体中抗病相关的生理指标
•     3.3 UGT73C4对烟草叶片的瞬时转化实验
•     3.4 UGT73C4突变体和过表达体中抗病相关基因表达的差异
•     3.5 UGT73C4突变体和过表达体中SA含量的比较
•     3.6 病原菌对UGT73C4的诱导表达部分依赖于SA
•   4 UGT73C4基因在植物根部表达并参与真菌的抗病作用
•     4.1 UGT73C4基因在植物根部受真菌Foc699-GFP诱导表达
•     4.2 真菌Foc699-GFP诱导后UGT73C4启动子:GUS表达分析
•     4.3 UGT73C4突变体和过表达体根中Foc699-GFP荧光含量检测
•     4.4 UGT73C4突变体和过表达体根中Foc699-GFP荧光观察
•     4.5 Foc699-GFP处理后UGT73C4突变体和过表达体生长表型比较
•     4.6 UGT73C4突变体和过表达体中抗真菌相关基因表达的差异
•     4.7 UGT73C4基因在根部受Me-JA诱导表达
•     4.8 土壤真菌侵染后不同株系根部的活性氧积累
•   5 原核表达载体的构建及酶蛋白纯化和体外酶促反应
•     5.1 原核表达载体的构建
•     5.2 UGT73C4在原核细胞中的表达与纯化
•     5.3 体外酶促反应与底物筛选
• 四 讨论
•   1 糖基转移酶UGT73C4在植物抗病反应中具有重要作用
•   2 糖基转移酶UGT73C4底物的推测及可能的抗病机制
•   3 糖基转移酶UGT73亚家族在植物抗病性适应进化中的功能
• 五 论文创新点与不足之处
•   总结与创新点
•   不足之处及需要进一步解决的问题
• 六 其它基因的研究总结
• 七 在校期间发表文章和奖励
• 附表：本论文用到的引物序列
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱国庆

导师: 侯丙凯

关键词: 拟南芥,糖基转移酶,植物抗病,水杨酸

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,植物保护

单位: 山东大学

分类号: Q943.2;S432.23

总页数: 84

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