禽腺病毒血清4型入侵LMH细胞途径的研究

论文摘要

禽肝炎-心包积液综合征（Hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS）是由禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的一类急性高致病性传染病。自2015年我国爆发以来,迅速传播蔓延至全国。目前,关于FAdV-4的研究还主要集中在病毒基因组分析、病原检测等方面,有关FAdV-4在宿主细胞上的增殖特性及入侵途径还尚不明确。本研究选取鸡肝癌细胞（Leghorn male hepatocellular cells,LMH）作为研究对象,进行了FAdV-4在LMH细胞上增殖规律及入侵途径的研究,从而对FAdV-4入侵宿主细胞的机制研究提供了理论基础。结果如下:（1）不同感染复数的FAdV-4接种LMH细胞后的增殖规律有较大差异。用FAdV-4感染LMH细胞后,通过Real-time PCR及Western blot检测FAdV-4病毒拷贝数及Hexon蛋白表达量。研究发现,以MOI=1接种LMH细胞后,FAdV-4病毒拷贝数及Hexon蛋白表达量在感染后72 h到达最高。以MOI=10接种LMH细胞后,Hexon蛋白表达量在感染后12 h内不断升高,并在12 h达到最高,在24 h有所下降。通过入侵动力学试验及激光共聚焦显微镜观察,发现FAdV-4完成对LMH细胞的入侵需要约60 min。（2）FAdV-4入侵LMH细胞不依赖胞内酸性环境但需要发动蛋白（Dynamin）参与。用胞内酸性环境抑制剂氯化铵（NH4Cl）,氯喹（Chloroquine）及Dynamin抑制剂3-羟基-2-萘甲酸（Dynasore）分别处理LMH细胞2 h后,接种FAdV-4,进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示,与对照组相比,NH4Cl和Chloroquine处理组中代表病毒粒子的特异性绿色荧光没有明显胞膜聚集现象,Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数也未显著下降。表明FAdV-4入侵LMH细胞不依赖胞内酸性环境。Dynasore处理组中代表病毒粒子的特异性绿色荧光有明显胞膜聚集现象,同时Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数也显著下降。表明FAdV-4入侵LMH细胞需要Dynamin分子参与。（3）FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径。FAdV-4感染LMH细胞后进行透射电镜观察,发现了内吞作用的存在。用网格蛋白抑制剂氯丙嗪（CPZ）处理LMH细胞2 h后,接种FAdV-4,进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示,与对照组相比,病毒粒子的定位无明显差异,Hexon蛋白的表达量和病毒拷贝数也无显著变化。表明FAdV-4入侵LMH细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径。用小窝蛋白抑制剂制霉素（Nystatin）和甲基-β-环糊精（MβCD）处理LMH细胞2 h后,接种FAdV-4,进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示,代表病毒粒子的特异性绿色荧光有明显胞膜聚集现象,Hexon蛋白表达量和病毒拷贝数均显著下降,表明FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径。（4）FAdV-4入侵LMH细胞还依赖巨胞饮途径且需要PI3K分子的参与。用巨胞饮途径的抑制剂阿米洛利（EIPA）及相关分子PI3K的抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）处理LMH细胞2 h后,接种FAdV-4,进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示,与对照组相比,代表病毒粒子的绿色荧光明显聚集在胞膜,Hexon蛋白表达量和病毒拷贝数均显著下降,表明FAdV-4入侵LMH细胞还依赖巨胞饮途径且需要PI3K分子的参与。综上所述,本研究发现FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径及巨胞饮途径且需要Dynamin与PI3K分子的参与,但无pH依赖性。这为新型抗病毒药物的靶点选择提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 文献综述
•   第一章 禽腺病毒血清4型及细胞入侵途径的研究进展
•     1.1 禽腺病毒血清4型研究进展
•       1.1.1 病原学
•       1.1.2 流行病学
•       1.1.3 临床症状与病理变化
•       1.1.4 诊断方法
•       1.1.5 防治措施
•     1.2 病毒入侵细胞途径的研究进展
•       1.2.1 膜融合作用入侵细胞
•       1.2.2 内吞作用入侵细胞
•       1.2.3 巨胞饮作用
•       1.2.4 其他入侵细胞途径
•     1.3 本研究的目的与意义
• 试验研究
•   第二章 FAdV-4在LMH细胞上增殖规律及入侵动力学研究
•     2.1 材料
•       2.1.1 细胞与病毒
•       2.1.2 主要试剂
•       2.1.3 主要仪器
•       2.1.4 主要溶液配制
•     2.2 方法
•       2.2.1 细胞培养
•       2.2.2 FAdV-4 扩增及病毒滴度测定
•       2.2.3 FAdV-4 入侵动力学实验
•       2.2.4 实时荧光定量PCR检测
•       2.2.5 激光共聚焦显微镜观察
•       2.2.6 蛋白免疫印迹检测（Western blot）
•     2.3 结果
•       2.3.1 FAdV-4 感染LMH细胞后CPE观察
•       2.3.2 FAdV-4 感染LMH细胞的TCID50 测定
•       2.3.3 FAdV-4在LMH细胞上的增殖规律研究
•       2.3.4 FAdV-4 感染LMH细胞的入侵动力学研究
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 FAdV-4 入侵LMH细胞途径的研究
•     3.1 材料
•       3.1.1 细胞与病毒
•       3.1.2 主要试剂
•       3.1.3 主要仪器
•     3.2 方法
•       3.2.1 细胞培养
•       3.2.2 CCK法筛选化学抑制剂最适浓度
•       3.2.3 透射电镜观察
•       3.2.4 实时荧光定量PCR检测
•       3.2.5 激光共聚焦显微镜观察
•       3.2.6 蛋白免疫印迹检测（Western blot）
•       3.2.7 数据统计学分析
•     3.3 结果
•       3.3.1 化学抑制剂最适浓度筛选
•       3.3.2 透射电镜发现FAdV-4 入侵LMH细胞与内吞及巨胞饮途径相关
•       3.3.3 FAdV-4 入侵LMH细胞不依赖胞内酸性环境但需要Dynamin参与
•       3.3.4 FAdV-4 入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径
•       3.3.5 FAdV-4 入侵LMH依赖于巨胞饮途径且需要PI3K的参与
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李炜

导师: 王晶钰

关键词: 禽腺病毒血清型,增殖规律,内吞途径,巨胞饮途径,鸡肝癌细胞

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

分类号: S852.65

总页数: 56

文件大小: 2855K

下载量: 202