四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究

论文摘要

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病,广西养禽业由该病造成的经济损失非常大。鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）基因组十分容易发生变异,不同国家或地区IBV流行株的基因组存在很大的差异。为了进一步阐明广西IBV分子致病变异机制和致病机理,有效控制该病,促进广西养禽业健康发展,非常有必要对广西IBV流行株进行全基因组测序分析和致病性研究。因此,本研究对四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列进行测定,并对获取的全基因组序列进行生物信息学分析,最后对该四株IBV变异株进行SPF鸡和樱桃谷肉鸭的动物回归试验,对其进行致病性研究,旨在为本地区IB防控提供依据。第一,采用高通量测序技术对IBV变异株GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株进行全基因组序列测定,分别对四株样品进行RNA提取、反转录、文库构建、测序和数据分析。研究结果显示:（1）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株全基因组核苷酸序列长度分别为27477 bp、27751 bp、27674 bp和27663 bp;（2）四株IBV基因组结构均符合经典的结构:5’-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。第二,对获得的四株IBV全基因组序列进行生物信息学分析,包括全基因组序列碱基插入和缺失分析、相似性分析、系统发育分析、重组分析、S1蛋白裂解位点分析、糖基化位点分析和RNA茎环结构预测。结果显示:（1）四株代表性IBV变异株主要在基因组核苷酸2928～3428位、20490～20930位、21330～21550位、24180～24740位和27370～27440位存在明显的碱基插入和缺失现象;GX-N160421株在高度保守的N基因505～507bp处连续缺失3个碱基（aa:S）,为本地区首次发现的N基因连续缺失毒株。（2）GX-NN130048株与GX-YL9、YX1010和DY07株相似度较高,均在95.0%以上;GX-NN160421株与CKCHHB2016和GX-NN09032株相似度较高,均在96.4%以上;GX-QZ170728、GX-QZ171023株和YX10株相似度较高,分别为95.2%和95.3%。（3）GX-NN130048、GX-QZ170728和GX-QZ171023株主要与YX10和DY07株位于较近的发育分支树上;GX-NN160421株主要与GX-NN09032和CK株位于较近的发育分支树上。GX-NN130048和GX-QZ170728株S1基因均属于4/91-type,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1基因分别属于New-type和CK/CH/LSC/991-type。（4）GX-NN130048和GX-QZ170728株是来源于疫苗株4/91和LX4型野毒株的重组株,GX-NN130048株重组片段断点为1～20444和26981～27477,GX-QZ170728株重组片段断点为1～19046和26821～27674。（5）S1基因型为4/91-type的GX-NN130048和GX-QZ170728株的S1蛋白裂解位点为RRSRR,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1蛋白裂解位点分别为HRRKR和RRFRR。（6）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和 GX-QZ171023株S1基因N-糖基化位点分别为18、10、17和16个,N基因均为1个。（7）以基因组5’端前导序列为模板预测出3个RNA茎环结构,主要与4/91、M41、CQ04-1、SAIBK和SC021202株存在突变位点;以基因组ORF1b融合区为模板预测出2个茎环结构,主要与BJ和California株存在突变位点;其中茎环结构I是主要的核苷酸突变位点。本部分研究结果表明本地区IBV变异株主要由点突变和基因重组引起,基因组5’端前导序列和ORF1b融合区茎环结构可能对于基因重组具有重要作用,IB的防控面临更严峻的挑战。第三,为进一步了解四株代表性IBV变异株的致病性,本课题进行了G X-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株对SPF鸡以及鸭源GX-QZ170728株对樱桃谷肉鸭的致病性试验。将SPF鸡随机分为4组攻毒组和对照组,樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组。7日龄所有攻毒组的动物分别点眼滴鼻1×106 EID50的病毒液,对照组采用等量PBS替代。攻毒后每日观察各组临床症状,及时剖检死亡鸡,记录发病率和死亡率。采集0、1、7、11、14和21 dpi血清进行IBV特异抗体的检测;采集1、3、5、7、11、14和21 dpi气管、肺脏和肾脏制作组织切片及观察病理学变化,并使用荧光定量PCR检测气管、肾脏和肛拭子的病毒载量。结果表明:（1）攻毒24 h以后,攻毒鸡出现精神沉郁、羽毛松乱、体重下降、喘气、气管啰音和饮水量增加等临床症状;剖检鸡出现气管粘液和出血、肾肿大苍白和花斑肾等病变。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭无异常变化。（2）四株IBV攻毒鸡发病率为53.33%～100%,死亡率为2.22%～28.89%,GX-QZ171023组发病率和死亡率最高。鸭源GX-QZ170728株攻毒的樱桃谷肉鸭死亡率为0%。（3）0～21 dpi时攻毒组鸡的抗体水平逐渐升高,21 dpi时抗体滴度均大于试剂盒阳性判定值;整个试验期间对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭抗体水平一直较低且无变化。（4）组织病理学观察显示:四株病毒均导致气管黏膜结构混乱、上皮细胞变性坏死和大量炎细胞浸润,肺脏上皮细胞变性坏死、大量炎细胞浸润、局部肺淤血和肺房受压萎缩。GX-QZ171023组肾小管大量坏死、个别肾小球细胞坏死、萎缩,GX-NN130048组肾脏有少量淋巴细胞浸润,其余两组攻毒鸡肾脏无异常变化;对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭病理切片无异常变化。（5）荧光定量PCR检测结果显示:1～21 dpi时4组攻毒组鸡气管、肾脏和肛拭子均可检测到IBV;GX-NN130048组和GX-NN160421组气管病毒载量明显高于肾脏病毒载量;GX-QZ170728组和GX-QZ171023组肾脏病毒载量明显高于气管病毒载量。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭均未检测到IBV。本部分研究结果表明,四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本研究结果表明,广西IBV仍然不断变异,IBV变异株主要由点突变和基因重组引起;四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728分离株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本课题丰富了 IBV以及冠状病毒的全基因组生物信息库,为致病性研究提供依据,对广西乃至全国IB的防控具有重要的参考价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写、符号说明
• 第一章 文献综述
•   1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学的研究概论
•     1.1.1 鸡传染性支气管炎病毒的分类和形态
•     1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒的理化和生物特性
•   1.2 鸡传染性支气管炎发病机理和流行病学
•     1.2.1 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理变化
•     1.2.2 鸡传染性支气管炎的国外流行情况
•     1.2.3 鸡传染性支气管炎的国内流行情况
•     1.2.4 IBV变异株的研究进展
•   1.3 鸡传染性支气管炎病毒的致病性研究
•     1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒对呼吸器官的致病性
•     1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒对生殖器官的致病性
•     1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒对泌尿器官的致病性
•     1.3.4 鸡传染性支气管炎病毒对其他组织器官的致病性
•   1.4 鸡传染性支气管炎病毒基因组
•     1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构
•     1.4.2 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白与生物学功能
•     1.4.3 鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白与生物学功能
•     1.4.4 鸡传染性支气管炎病毒非编码区与生物学功能
•   1.5 鸡传染性支气管炎病毒全基因组生物信息学研究现状
•     1.5.1 鸡传染性支气管炎病毒全基因组测定分析的研究进展
•     1.5.2 生物信息学分析的理论基础
•     1.5.3 糖基化位点与蛋白裂解位点的理论基础
•     1.5.4 基因重组研究与RNA茎环结构研究
•     1.5.5 蛋白质立体结构研究与分子遗传变异研究
•   1.6 本课题的研究目的和意义
• 第二章 四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定
•   2.1 材料
•     2.1.1 IBV分离株背景
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 引物的选择及合成
•     2.2.2 病毒的增殖及纯化
•     2.2.3 病毒RNA的抽提及cDNA的合成
•     2.2.4 S1、E、M和N结构基因的克隆及序列测定
•     2.2.5 高通量测序IBV全基因组序列
•     2.2.6 一代测序与高通量测序的对比分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 病毒的纯化
•     2.3.2 IBV S1、E、M和N结构基因序列
•     2.3.3 IBV全基因组序列
•     2.3.4 一代测序与高通量测序的对比
•   2.4 分析与讨论
•   2.5 小结
• 第三章 四株广西代表性IBV变异株的生物信息学分析
•   3.1 材料
•     3.1.1 生物信息学分析数据
•     3.1.2 生物信息学分析软件
•   3.2 方法
•     3.2.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析
•     3.2.2 全基因组序列相似性分析
•     3.2.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析
•     3.2.4 全基因组序列的重组分析
•     3.2.5 S1蛋白裂解位点分析
•     3.2.6 糖基化位点分析
•     3.2.7 RNA茎环结构预测
•   3.3 结果
•     3.3.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析结果
•     3.3.2 全基因组序列相似性分析结果
•     3.3.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析结果
•     3.3.4 全基因组序列的重组分析结果
•     3.3.5 S1蛋白裂解分析结果
•     3.3.6 糖基化位点分析结果
•     3.3.7 RNA茎环结构预测结果
•   3.4 分析与讨论
•   3.5 小结
• 第四章 四株代表性IBV变异株的致病性试验
•   4.1 材料
•     4.1.1 试验用SPF鸡胚、SPF鸡及樱桃谷肉鸭
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 方法
• 50)的测定'>    4.2.1 鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定
•     4.2.2 SPF鸡及樱桃谷肉鸭分组与攻毒
•     4.2.3 病料的采集与处理
•     4.2.4 试验动物外周血血清抗体水平的检测
•     4.2.5 试验动物组织切片的制作与观察
•     4.2.6 试验动物组织器官病毒载量检测
•   4.3 结果
• 50)的测定结果'>    4.3.1 鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定结果
•     4.3.2 临床症状与剖检症状
•     4.3.3 试验动物外周血血清抗体水平检测结果
•     4.3.4 试验动物组织病理变化结果
•     4.3.5 试验动物组织器官病毒载量检测结果
•   4.4 分析与讨论
•   4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董志华

导师: 磨美兰

关键词: 鸡传染性支气管炎病毒,全基因组序列,生物信息学分析,致病性

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 广西大学

分类号: S852.65

总页数: 87

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