阿依古丽?卡列木汗
（新疆吉木萨尔县中医医院药剂科831700）
【摘要】采用多聚赖氨酸为表面活性剂，将正硅酸乙酯与无水乙醇按１:４摩尔比混合成混合溶液，加入去离子水，调节溶液PH值陈化制得凝胶，凝胶在80℃下干燥2h，最后放进高温炉中600℃烧结制得最终样品SiO2。对所得SiO2纳米颗粒的安全性进行MTT细胞实验和搭载抗癌药物鬼臼毒素的实验。同时对鬼臼毒素的安全性进行MTT实验。MTT数据表明：实验所得两组SiO2对A549癌细胞生长抑制率均较小，毒性较小，可作为抗癌药物载体。鬼臼毒素对细胞生长抑制作用较强，SiO2纳米颗粒可搭载抗肿瘤药物鬼臼毒素，并对其红外谱图进行了研究，证明无机纳米SiO2能够有效的与鬼臼毒素相结合及该复合药物载体的有效性。
【关键词】二氧化硅纳米颗粒MTT鬼臼毒素
【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）20-0053-03
引言
针对抗肿瘤药物鬼臼毒素耐药性、水溶性差，严重的骨髓抑制以及口服利用率低、个体性差异大等缺点，拟采用纳米SiO2（MSP）搭载抗肿瘤药物鬼臼毒素，研究其对鬼臼毒素药物输运效果以及不同聚集态所导致的介孔尺寸和形状对药物的封装包裹能力的影响；进而研制出一种副作用小、水溶性好，并能通过减少因为药物释放过程中药物浓度变化产生的阻碍效应而提高单位比表面积载药量和实现控释给药的无机-有机复合体。
该项目针对性强，具有较高的实际应用价值，涉及到该项目的抗肿瘤药物鬼臼毒素和药物载体MSP材料的国内外研究现状和趋势总结如下：
鬼臼毒素(PdoPohyllotoxin，化合物1)及相关木脂素是一类具有显著细胞毒性的天然活性物质，主要来源于小檗科的八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(Podophyllum)和山荷叶属(Diphylleia)及大麻科和柏科的少数科属中。在我国的甘肃、青海等地分布较多。二十世纪四十年代，King和Shliivan首次报道了鬼臼毒素具有类似秋水仙碱的作用，并进一步证实其具有抗癌活性。由于其严重的毒副作用，限制了其在临床上的应用，但人们并没有放弃对鬼臼类化合物的研究，而是对鬼臼类化合物的结构进行了大量的改造，七十年代中期筛选出的Etoposide(VP-16,2)和Teniposide(VM-26,3)及九十年代中期推出的Etpoophos3，(VP-16的前药)就是其中的代表。其中VP-16作为拓扑异构酶-Ⅱ(topoisomerase-Ⅱ，TOP-Ⅱ)抑制剂，对小细胞肺癌、非何杰氏病、单核细胞白血病、乳腺癌、膀胧癌等众多肿瘤有较好的治疗效果。
一：无机纳米二氧化硅微粒的制备
1.仪器与材料
1.1实验仪器
DF-Ⅱ(集热式恒温加热磁力搅拌器金坛市恒丰仪器有限公司），SILX-4-13（箱式电阻炉北京科伟永兴仪器有限公司），HH-5（恒温油浴锅北京科伟永兴仪器有限公司）
1.2实验材料
正硅酸乙酯（分析纯Z-40-670.929%-0.939%），无水乙醇（分析纯.AR200304100999.7%），去离子水，盐酸，氨水(分析纯.ARXK13-201-005040.90g/ml)，赖氨酸（分析纯.ARL-11-51298%）
2.实验方法
2.1.制备思路及简述：
纳米SiO2的制备将正硅酸乙酯与无水乙醇按1:4的摩尔比混合，经搅拌成均匀地混合溶液，在搅拌状态下按1:4的比例缓慢加入去离子水，滴加适量的胶溶液（如盐酸或氨水等）调节溶液PH值，将所得溶液搅拌2h后在室温下陈化制得凝胶，凝胶在80℃下干燥2h。放进高温炉中600℃烧结制得样品（SiO2）。
2.2.制备流程图图1所示：
图1.二氧化硅纳米颗粒制备流程图
Figure1．silicananoparticlepreparationflowchart
备注：图1中所示比值均为摩尔比
二：无机纳米二氧化硅微粒性状电镜研究
采用OLYMPUSIX51型扫描电镜对经煅烧制备的样品的外观形态进行表征。所得的载体粒子外观大致为球形。粒子大小主要集中在200～250nm之间。
电镜图图2所示。
图2.二氧化硅纳米颗粒电镜图
Figure2.silicananoparticleselectronmicroscope
三、A549细胞对无机纳米二氧化硅颗粒的敏感性检查
为了考察A549人肺腺癌细胞对SiO2纳米颗粒的敏感性，我们将与纳米颗粒作用后的细胞分别培养至24h、48h、72h后,对细胞进行MTT分析,在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。检测细胞的活性程度,从而确定细胞对纳米颗粒的敏感性。
1、仪器与材料
1.1、实验仪器
HIRAYAMAHVE-50(高压灭菌锅日本)、HealForce-RO（超纯水器上海利康生物医疗科技控股有限公司）、DHG-907385-111（新苗电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械有限公司）、VELOCITY18R（低温高速台式离心机驭锘实业(上海)有限公司）、ZHWY-110X30（往复式水浴恒温锅常州诺基仪器有限公司）、DiscoveryDV314C（专业型分析天平美国）、JJ-3（控温磁力搅拌器金坛市恒丰仪器有限公司）、SW-CJ-ZP（单人净化工作台苏州净化设备有限公司）、OLYMPUSIS-ILL30（电子显微成像系统美国）、MCO-18AIC（三洋CO2培养箱日本三洋）、BiopettePro（单道移液枪美国赛泰克）、BIO-RAD（伯乐酶标仪美国伯乐）
1.2、实验材料
HycloneDMEM/F12（1:1NXM0769赛默飞世尔生物化学物品有限公司）、Hyclone0.25%胰蛋白酶（1X）溶液（NWM0527赛默飞世尔生物化学物品有限公司）、Hyclone胎牛血清（NWL0509NWM0527赛默飞世尔生物化学物品有限公司）、PBS磷酸盐缓冲液（PH7.2-7.4Zli-9062北京中杉金桥生物技术有限公司）、TRIS（FW-121-14≥99.9%（titration）crstaline）、氢氧化钠（分析纯≥96%GT/T629-1997天津益达化工有限公司）、Hyclone(Exp20180625MW7507赛默飞世尔生物化学物品有限公司)
2、试验方法
2.1细胞的复苏
Ａ５４９细胞冻存管从-80℃冻存箱中取出，37℃温水中摇动使融化。1000～２000r离心3～５min。用75%的乙醇擦拭后轻轻打开。除去上清液后加入1ml细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。补充4ml的细胞培养基和10%的胎牛血清。倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。24h后，更换新的培养液，常规传代培养。
2.2A549细胞的传代
无菌操作打开培养瓶瓶盖后吸去原培养液。加入胰酶1ml，使胰酶流遍所有的细胞表面，吸去消化液，PBS液冲洗细胞表面2～３遍去除原培养液中的牛血清。至细胞的胞质回缩、胞间质增大后终止消化。加入5ml培养液，用移液枪反复吹打以分散细胞。吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液并添加10%～20%的胎牛血清。37℃、5%CO2培养。培养一段时间观察到细胞贴培养瓶壁，证明细胞传代成功。倒置显微镜下观察并用显微电镜成像系统拍照如图3所示，观察细胞形态为长棱形。
图3.A549细胞电镜照片
Figure3.A549cellsSEMphotos
2.3、MTT实验方法
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使细胞密度至约3000个每孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。5%CO2，37℃条件下孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。隔夜加样品药物。将无机纳米SiO2每组精确称量2mg加入无菌配液管中，121℃高压灭菌30min。配6个浓度梯度的SiO2纳米颗粒的无菌溶液（浓度梯度表1所示）,每孔加100ul，每个浓度梯度6个复孔.设一个空白对照组（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）和一个调零组（培养基、MTT、二甲基亚砜）。5%CO2，37℃条件下孵育24小时，倒置显微镜下观察。24h、48h后，分别取A、B两组各一块板加MTT，每孔加10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），培养4h。吸去孔中培养液，每孔加入二甲基亚砜10ul，低速振荡10min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。相同方法对看肿瘤药物鬼臼毒素进行MTT实验，配4个浓度梯度的抗肿瘤药物鬼臼毒素无菌溶液（浓度梯度表2所示）.
表1.MTT实验SiO2浓度梯度
Table1.MTTexperimentaldrugconcentrationgradient
3.2结果分析
为了考察SiO2纳米颗粒与细胞作用后对细胞生长的影响,将与SiO2纳米颗粒作用后的细胞分别培养至24h，48h后,对细胞进行酶联免疫检测仪OD570nm处分析,检测细胞的活性程度。药物对细胞生长抑制率和加SiO2纳米颗粒浓度及其不同时间的关系柱状图见图5和图6.
从图5可知,A组SiO2纳米颗粒在培养细胞中加入的SiO2纳米颗粒的量控制在一定范围内,即在培养细胞中加入的浓度为1mg/ml-0.03125mg/ml的纳米颗粒，对细胞生长的抑制作用都不是很明显。从SiO2浓度分析，不同浓度对细胞的生长抑制作用是基本接近的，在浓度为0.125mg/ml培养24h时，其对细胞的生长抑制率达到16.91%。为本组实验细胞生长抑制作用的最高值。
该数据分析说明A组SiO2纳米颗粒对细胞生长抑制作用不很明显，毒性较小，安全性高，可以考虑做为抗癌药物的纳米载体进行研究使用。
图5.A组SiO2细胞生长抑制率，浓度和培养时间的柱状图
Table5.GroupASiO2cellgrowthinhibitionrate,concentrationandincubationtimehistogram
从图6可知,B组SiO2纳米颗粒对细胞生长的抑制作用都不是很明显，但是比A组的抑制作用强。从SiO2浓度分析，对细胞的生长促进作用是基本接近的，略呈不规则变化趋势。从细胞培养时间分析，0.5mg/ml培养48h时，对细胞的生长抑制率达到30.58%。为本组实验细胞生长抑制作用的最高值。
该数据分析说明B组SiO2纳米颗粒对细胞生长抑制作用较B组明显，毒性较A组大，安全性较差，但整体来抑制作用不是很高。B组SiO2纳米颗粒安全性较A组差，综合比较应选用A组样品进行载药实验安全性较高。
表6.B组SiO2细胞生长抑制率，浓度和培养时间的柱状图
Table6.GroupBSiO2cellgrowthinhibitionrate,concentrationandincubationtimehistogram
从图7可知,鬼臼毒素对细胞生长的抑制作用很明显，在相对前面两组SiO2浓度降低二十倍的条件下，对细胞生长的抑制作用强于SiO2。48h对细胞生长抑制作用整体强于24h。50ug/ml培养48h时，对细胞的生长抑制率达到38.87%。为本组实验细胞生长抑制作用的最高值。
该数据分析说明鬼臼毒素对细胞生长抑制作用明显，毒性较大，是比较理想的抗肿瘤药物。可以与SiO2进行搭载实验。
表7.鬼臼毒素对细胞生长抑制率，浓度和培养时间的柱状图
Table7.Theinhibitoryrateofcellgrowthandpodophyllotoxin,concentrationandincubationtimehistogram
结论
本论文优选一种二氧化硅纳米颗粒的基因载体的制备方法，成功制得平均粒径200nm-250nm的二氧化硅纳米颗粒并对材料载体的细胞毒性进行评价。MTT实验表明：无机纳米二氧化硅具有良好的稳定性，对细胞生长没有较明显的毒性，鬼臼毒素对细胞生长抑制作用明显，毒性较大，是比较理想的抗肿瘤药物。证明鬼臼毒素可以与所得的二氧化硅纳米颗粒进行搭载实验，预期得到一种有机-无机复合体的抗肿瘤药物。
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