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酿酒酵母中DNA损伤检查点clamp 9-1-1复合体和clamp loader Rad24-RFC的结构解析和相互作用研究

2020-12-09阅读(559)

酿酒酵母中DNA损伤检查点clamp 9-1-1复合体和clamp loader Rad24-RFC的结构解析和相互作用研究

论文摘要

基因组不断受到来自内外环境的压力（如紫外线和电离辐射等）造成DNA损伤。细胞内DNA损伤触发细胞周期检查点激活,导致细胞周期进程延迟或阻滞,阻止细胞复制并且诱导细胞进行DNA损伤修复。Clamp 9-1-1复合体和clamp loader Rad24-RFC在细胞周期检查点激活方面起着重要作用。9-1-1复合体是由Rad9-Hus1-Rad1组成的环形异源三聚体复合物,其中Rad9/Ddc1的C端含有大量磷酸化的位点和蛋白相互作用位点,包括DNA损伤修复关键激酶ATR和TopBP1等。但是由于Rad9/Ddc1 C端结构柔性程度高,目前还没有9-1-1复合体的完整结构。解析9-1-1复合体在不同状态下的（包括DNA损伤条件下）完整结构,尤其是获得Rad9/Ddc1的结构变化能够更好地帮助我们理解9-1-1复合体如何参与DNA损伤响应。Rad24-RFC是一个异源五聚体,由最大的亚基Rad24和四个小亚基RFC2-5组成。在DNA损伤修复过程中,Rad24-RFC负责协助9-1-1复合体加载到DNA损伤位点,起到稳定DNA构象和激活DNA损伤检查点的作用。基于9-1-1复合体与增殖细胞核抗原（PCNA）在结构上的相似性,目前认为9-1-1复合体与Rad24-RFC间相互作用可能与PCNA与RFC间相互作用相似,但是目前并没有直接的证据表明9-1-1复合体与Rad24-RFC行使相似的机制。因此,获得9-1-1复合体与Rad24-RFC复合物的完整结构及其动态相互作用的结构信息将会极大地帮助我们理解clamp加载过程,但是目前还没有二者相互作用的结构信息,甚至连Rad24-RFC的结构信息也很少。本课题我们利用冷冻电镜技术解析了酿酒酵母中9-1-1复合体的完整结构,首次解析了Ddc1亚基的全长结构并发现Ddc1结构柔性受到精细调节。在正常生理状态下,9-1-1复合体具有多种构象,Ddc1 C-tail是高度动态的。我们获得了三种相对稳定的构象,包括Ddc1 C-tail位于环状区域的阻挡DNA结合的构象,Ddc1 C-tail远离环状区域的闭合构象以及环打开的开口构象。甲基磺酸甲酯（MMS）是一种DNA损伤诱导剂,能够造成细胞基因组发生断裂,为了深入研究,我们也获得了MMS诱导条件下的9-1-1复合体。在生化上,MMS诱导的9-1-1复合体的Ddc1亚基在电泳上迁移出多条条带,质谱结果显示均为Ddc1,考虑到Ddc1 C-tail包含众多磷酸化位点,这暗示在DNA损伤条件下Ddc1发生了不同程度的磷酸化。同时我们也解析了MMS诱导的9-1-1复合体的完整结构,与正常生理状态下的9-1-1复合体结构相比,MMS诱导的9-1-1复合体构象变得均一,Ddc1 C-tail主要位于环状区域外。基于生化和结构分析,Ddc1 C-tail的结构柔性很大可能与DNA损伤响应相关。Rad53作为DNA损伤响应的效应激酶,是DNA检查点激活的重要指示剂,我们的磷酸化实验发现,Ddc1 C-tail敲除将会导致G1/G2期Rad53的磷酸化完全丧失或降低,这一数据说明Ddcl C-tail在DNA损伤响应中发挥着重要作用。为了解析Rad24-RFC的结构,我们尝试了内源性表达和重组表达。在内源性纯化Rad24-RFC时,我们发现能够共纯化出Mec1/Ddc2（ATR/ATRIP）,二维结构分析也发现存在二者复合体。在之前的研究中Rad24-RFC一直被认为作为clamp loader协助9-1-1复合体加载到DNA损伤位点,一旦完成,Rad24-RFC将会从DNA损伤处解离。我们的共纯化结果或许暗示了Rad24-RFC在体内能够与Mec1/Ddc2发生直接的相互作用。由于内源性纯化的Rad24-RFC浓度和均一度比较低,因此我们尝试重组表达获得Rad24-RFC样品。在高盐、高去垢剂的纯化条件下,我们获得了高浓度和高纯度的Rad24-RFC,同时我们也首次解析了Rad24-RFC的完整结构。在负染结构中,Rad24-RFC部分构象呈现出“U”型结构,中间含有一条深沟;部分构象呈现出“爪”型。参与DNA复制的clamp loader RFC复合体（RFC1-5）与Rad24-RFC共享了四个相同的小亚基RFC2-5,基于RFC复合体的晶体结构,我们确定了Rad24模块结构。同时我们将RFC1与Rad24的density进行单独比较,二者结构十分相似。结合PCNA与9-1-1复合体的结构相似性,Rad24-RFC与RFC复合体的结构相似或许暗示着这两对clamp-clamp loader的相互作用机制存在一定的相似。基于以上结构信息,我们也对9-1-1复合体与Rad24-RFC间相互作用进行了研究,我们发现,二者相互作用在体内受到DNA损伤应激调控。在体外我们也成功组装了Rad24-RFC/9-1-1超级复合物,这也为我们后续解析三维结构奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 背景介绍
  •   1.1 DNA损伤响应过程
  •   1.2 9-1-1复合体背景介绍
  •   1.3 9-1-1复合体激活Mec1/Ddc2
  •   1.4 Rad24-RFC背景介绍
  •   1.5 Clamp-loading过程
  •   1.6 冷冻电镜三维重构方法介绍
  •   1.7 本课题的研究内容与意义
  • 第二章 材料和方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 内源性表达带有标签的9-1-1复合体和Rad24-RFC复合体菌株
  •     2.1.2 重组表达带有标签的Rad24-RFC复合体菌株
  •   2.2 酵母克隆的构建
  •     2.2.1 扩增标签和筛选标记
  •     2.2.2 酵母感受态细胞的制备
  •     2.2.3 酵母细胞的转化
  •   2.3 目的蛋白的检测
  •     2.3.1 提取酵母细胞的总蛋白
  •     2.3.2 Western blotting检测目的蛋白
  •     2.3.3 提取酵母细胞的基因组
  •     2.3.4 PCR测序验证酵母单克隆
  •   2.4 酵母细胞的扩大培养、收集和破碎
  •     2.4.1 酵母培养基的配制
  •     2.4.2 酵母细胞的扩大培养和收集
  •     2.4.3 酵母细胞诱导培养和收集
  •     2.4.4 过表达Rad24-RFC酵母细胞培养和收集
  •     2.4.5 酵母细胞的破碎
  •   2.5 酵母蛋白的纯化及检测
  •     2.5.1 IgG亲和层析纯化目的蛋白
  •     2.5.2 FLAG亲和层析纯化目的蛋白
  •     2.5.3 GST亲和层析纯化目的蛋白
  •     2.5.4 离子交换提纯和浓缩目的蛋白
  •     2.5.5 酵母蛋白的纯化检测
  •   2.6 电镜观察和分析蛋白样品
  •     2.6.1 电镜样品的制备
  •     2.6.2 电镜样品观察和数据收集
  •     2.6.3 电镜数据分析
  •   2.7 Rad53磷酸化检测
  •   2.8 9-1-1复合体和Rad24-RFC复合体相互作用实验
  •     2.8.1 体内pull down实验
  •     2.8.2 体外孵育实验实验
  • 第三章 9-1-1复合体纯化及负染结构分析
  •   3.1 引言
  •   3.2 Ddc1 C-tail截短的9404-1-1复合体纯化及结构分析
  •     3.2.1 检测9404-1-1复合体的表达信号
  •     3.2.2 FLAG亲和层析纯化9404-1-1复合体
  •     3.2.3 离子交换层析纯化9404-1-1复合体
  •     3.2.4 电镜分析纯化的9404-1-1复合体
  •     3.2.5 电镜分析9404-1-1复合体的三维结构
  •   3.3 完整的9-1-1复合体纯化及结构分析
  •     3.3.1 检测9-1-1复合体的表达信号
  •     3.3.2 IgG亲和层析纯化9-1-1复合体
  •     3.3.3 离子交换纯化9-1-1复合体
  •     3.3.4 电镜分析纯化的9-1-1复合体
  •     3.3.5 电镜分析9-1-1复合体的三维结构
  •   3.4 MMS诱导的9-1-1复合体纯化及结构分析
  •     3.4.1 IgG亲和层析纯化MMS诱导的9-1-1复合体
  •     3.4.2 离子交换纯化MMS诱导的9-1-1复合体
  •     3.4.3 电镜分析纯化的MMS诱导的9-1-1复合体
  •     3.4.4 电镜分析MMS诱导的9-1-1复合体的三维结构
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 完整9-1-1复合体冷冻电镜结构分析
  •   4.1 引言
  •   4.2 完整9-1-1复合体冷冻样品制备和数据收集
  •   4.3 完整9-1-1复合体冷冻电镜结构分析
  •     4.3.1 完整9-1-1复合体冷冻电镜数据处理
  •     4.3.2 完整9-1-1复合体冷冻电镜结构分析
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 Ddc1 C-tail截短对9-1-1复合体功能影响
  •   5.1 引言
  •   5.2 Rad53磷酸化实验检测
  •     5.2.1 G1期Rad53磷酸化检测
  •     5.2.2 G2期Rad53磷酸化检测
  •   5.3 9-1-1复合体与Mec1/Ddc2孵育实验分析
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 Rad24-RFC纯化及结构分析
  •   6.1 引言
  •   6.2 Rad24-RFC内源性纯化
  •     6.2.1 检测Rad24-RFC的表达信号
  •     6.2.2 FLAG亲和层析纯化Rad24-RFC
  •     6.2.3 离子交换纯化Rad24-RFC
  •     6.2.4 电镜分析纯化的Rad24-RFC
  •   6.3 Rad24-RFC重组表达
  •     6.3.1 检测Rad24-RFC表达信号
  •     6.3.2 GST亲和层析纯化Rad24-RFC
  •     6.3.3 离子交换纯化Rad24-RFC
  •     6.3.4 电镜分析纯化的更Rad24-RFC
  •     6.3.5 电镜分析Rad24-RFC的三维结构
  •   6.4 本章小结
  • 第七章 9-1-1复合体与Rad24-RFC相互作用研究
  •   7.1 引言
  •   7.2 9-1-1复合体与Rad24-RFC体内相互作用研究
  •   7.3 9-1-1复合体与Rad24-RFC体外组装
  •   7.4 本章小结
  • 第八章 结论与展望
  •   8.1 结论
  •   8.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘伟

    导师: 蔡刚

    关键词: 损伤响应,复合体,三维重构

    来源: 中国科学技术大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 中国科学技术大学

    分类号: Q75

    总页数: 108

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