保加利亚乳杆菌细胞壁蛋白酶对GDL乳凝胶性能影响的研究

论文摘要

细胞壁蛋白酶（CEP）是一种锚定在乳酸菌细胞壁上的水解酶,其作用底物为酪蛋白,而酪蛋白水解是酸奶发酵过程中的关键一步,所以细胞壁蛋白酶会对酸奶的发酵产生一定的影响。有研究发现乳酸菌细胞壁蛋白酶会改善乳凝胶的质地,因此本研究提取了细胞壁蛋白酶,并且重点分析细胞壁蛋白酶对乳凝胶性能的影响。本研究对乳酸菌CH9-3菌株进行了16S rDNA序列测定和API鉴定,确定该菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）。随后利用PCR及基因克隆技术获得了CH9-3菌株的细胞壁蛋白酶基因序列,并使用NCBI数据库、DNAstar和BioEdit等软件对基因序列进行了生物信息学分析,发现该基因序列所编码的蛋白质含有1976个氨基酸,其中包括1494个亲水氨基酸,该蛋白为亲水性蛋白;蛋白的不稳定系数为18.75,具有较强的稳定性;二级结构中不规则卷曲占56.88%,延伸主链占22.93%,α-螺旋仅占20.19%。利用5 mol/L LiCl粗提取细胞壁蛋白酶,再使用DEAE Sefinose TM FF琼脂糖凝胶及超滤技术对蛋白酶进行纯化,通过SDS-PAGE验证,获得大小为190 kDa的单一电泳条带,通过QE质谱鉴定及水解酪蛋白验证,确定所提取的酶来自细胞壁。此外,对葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）酸化脱脂乳模型进行优化,结果表明,GDL的添加量为1.75%时,最适合作为酸化模型模拟酸奶发酵过程;随后将所纯化的蛋白酶加入到GDL酸化的乳凝胶中,发现乳凝胶性能受到影响,其中,乳凝胶的游离氨基酸含量显著提高（P<0.05）;质地显著增强:硬度、稠度、粘度和粘附性指数分别显著增加（P<0.05）;大粒径的分布显著增加（P<0.05）;Zeta电位显著降低（P<0.05）;脱水收缩系数显著降低（P<0.05）。本研究发现来自CH9-3菌株的细胞壁蛋白酶通过提高乳凝胶的硬度、稠度、粘度指数和增加其蛋白水解程度,同时降低其脱水收缩率,显著提高了乳凝胶的质量,而且细胞壁蛋白酶还可以通过降低乳凝胶的表面电荷来促进乳凝胶的形成,进而改善乳凝胶的性能。因此,CH9-3菌株的细胞壁蛋白酶对乳凝胶的性质有积极作用,在酸奶及其他蛋白产品制造业具有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 引言
•   1.1 立题背景及研究的目的和意义
•   1.2 文献综述
•     1.2.1 保加利亚乳杆菌概述
•     1.2.2 细胞壁蛋白酶水解系统
•     1.2.3 细胞壁蛋白酶提取方法研究进展
•     1.2.4 乳凝胶研究进展
•     1.2.5 细胞壁蛋白酶对乳凝胶性能影响
•   1.3 课题来源及主要研究内容
•   1.4 实验验技术路线图
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 供试菌株来源
•     2.1.2 质粒
•     2.1.3 扩增引物
•     2.1.4 主要培养基
•     2.1.5 主要仪器和设备
•     2.1.6 试剂盒
•     2.1.7 生化试剂
•     2.1.8 主要缓冲液及试剂配制
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 CH9-3 菌株种属鉴定
•     2.2.2 CEP基因测序
•     2.2.3 CEP生物信息学分析
•     2.2.4 CEP提取及纯化
•     2.2.5 CEP对酸化乳凝胶性能的影响
• 3 结果与分析
•   3.1 CH9-3 菌株种属鉴定
•     3.1.1 基因组的提取
•     3.1.2 PCR扩增16S rDNA序列
•     3.1.3 16 SrDNA序列的阳性重组克隆鉴定
•     3.1.4 16S rDNA测序结果及系统发育分析
•     3.1.5 生理生化鉴定
•   3.2 CEP基因测序
•     3.2.1 PCR扩增CEP基因
•     3.2.2 CEP基因的阳性重组克隆鉴定
•     3.2.3 CEP基因测序
•   3.3 CEP生物信息学分析
•     3.3.1 CEP基因开放阅读框分析
•     3.3.2 CEP一级结构分析
•     3.3.3 CEP二级结构及功能分析
•   3.4 CEP提取纯化
•   3.5 CEP质谱鉴定
•   3.6 CEP水解酪蛋白
•   3.7 CEP对酸化乳凝胶性能的影响
•     3.7.1 GDL对乳的酸化作用
•     3.7.2 CEP对乳凝胶的蛋白水解作用
•     3.7.3 CEP处理乳凝胶的质地分析
•     3.7.4 CEP处理乳凝胶的表观粘度
•     3.7.5 CEP处理乳凝胶的粒径
•     3.7.6 CEP处理乳凝胶的Zeta电位
•     3.7.7 CEP处理乳凝胶的脱水收缩系数
• 4 讨论
•   4.1 载体选择
•   4.2 CEP的提取
•   4.3 CEP对乳中酪蛋白的降解作用
•   4.4 CEP对酸化乳凝胶性能的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 肖明

导师: 张兰威,陈历俊

关键词: 保加利亚乳杆菌,细胞壁蛋白酶,生物信息学分析,酶提取,乳凝胶性能

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 东北农业大学

基金: 国家自然基金“乳酸菌蛋白酶特性及其对发酵乳凝乳品质影响”(590031)

分类号: TS201.3

总页数: 71

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