慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲除TGF-β1基因及其对鹿茸软骨细胞的影响

论文摘要

鹿茸是哺乳动物中极为特殊的骨质器官,它以惊人的生长速度发挥其周期性再生的能力,并且通过割茸创伤的无疤痕愈合,展现了其强大的免疫功能,使之成为各科研领域广为推崇的研究模型。鹿茸的发生与再生是多方面因素的合力所共同实现的,迄今为止,人们尚未能完全破解鹿茸发育的调控网络。转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）是一类多功能的生长因子,对细胞具有复杂的调控作用。已有研究表明,TGF-β及其受体在鹿茸顶端有大量表达,但其功能性研究却少有报道。因此,探究TGF-β在鹿茸快速生长阶段的重要作用成为本研究的主要目的。本研究利用生物信息学软件,对克隆得到的梅花鹿TGF-β1基因核苷酸序列及氨基酸序列相似性百分率、基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点及蛋白质的二级结构进行了预测,通过免疫组化分析了TGF-β1在鹿茸顶端不同组织的相对表达强度,表明TGF-β1在软骨层中表达水平最高,其次为间充质层和真皮层。为探究TGF-β1在鹿茸软骨细胞中的功能,本试验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除鹿茸软骨细胞中的TGF-β1基因。首先,针对梅花鹿TGF-β1序列设计3条gRNA寡核苷酸序列,退火后,与线性化的pBOBI载体进行连接,以完成敲除载体的构建;然后,在293T细胞中,对阳性敲除载体进行慢病毒包装,使其能够高效进入软骨细胞;最后,通过Western blot筛选TGF-β1基因敲除的软骨细胞。获得鹿茸软骨细胞TGF-β1基因敲除细胞系以后,通过EdU试验检测基因敲除软骨细胞体外增殖的变化,细胞划痕试验检测基因敲除软骨细胞的体外迁移情况,PCR array试验检测基因敲除对软骨细胞中TGF-β信号通路相关基因表达的影响,并结合荧光定量PCR和Western blot对其部分结果进行验证。结果显示,TGF-β1的缺失,抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖,促进了软骨细胞的迁移,导致TGF-β及其相关通路中11个相关基因的上调和9个相关基因的下调,推测当TGF-β1介导的TGF-β通路功能丧失时,BMP4介导的BMP信号通路可能发挥重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
•   第一章 鹿茸的发生与再生
•     1.1 鹿茸的结构
•     1.2 基于生茸区骨膜的鹿茸发生
•     1.3 基于角柄骨膜的鹿茸再生
•     1.4 鹿茸发生与再生的影响因素
•   第二章 TGF-β信号通路与鹿茸再生调控
•     2.1 TGF-β及其受体的结构
•     2.2 TGF-β/Smad信号通路的作用途径
•     2.3 TGF-β的生物学功能
•     2.4 TGF-β对鹿茸再生调控作用的研究
•   第三章 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的研究进展
•     3.1 CRISPR系统的基因座组成
•     3.2 CRISPR/Cas9 基因编辑的作用机制
•     3.3 携带CRISPR/Cas9 的理想载体——慢病毒系统
• 第二篇 研究内容
•   第一章 梅花鹿顶端组织TGF-β1基因的结构与表达分析
•     1.1 试验材料、试剂和仪器
•       1.1.1 材料
•       1.1.2 主要试剂
•       1.1.3 溶液配制
•       1.1.4 主要仪器
•     1.2 方法
•       1.2.1 鹿茸顶端组织总RNA的提取与反转录
•       1.2.2 梅花鹿TGF-β1 基因的克隆
•       1.2.3 重组质粒的核苷酸序列测定
•       1.2.4 梅花鹿TGF-β1 基因部分序列的生物信息学分析
•       1.2.5 免疫组化分析TGF-β1 在鹿茸顶端不同组织的表达水平
•     1.3 结果
•       1.3.1 鹿茸顶端软骨组织总RNA的提取
•       1.3.2 TGF-β1 基因部分序列的PCR扩增结果
•       1.3.3 重组质粒pMD-19T-TGF-β1的PCR与双酶切鉴定
•       1.3.4 梅花鹿TGF-β1 部分序列的生物信息学分析
•       1.3.5 梅花鹿TGF-β1 在鹿茸顶端不同组织的表达水平分析
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第二章 梅花鹿TGF-β1 基因CRISPR/Cas9 敲除载体的构建及慢病毒包装
•     2.1 试验材料、试剂和仪器
•       2.1.1 材料
•       2.1.2 主要试剂
•       2.1.3 溶液配制
•       2.1.4 主要仪器
•     2.2 方法
•       2.2.1 梅花鹿TGF-β1 基因外显子预测及gRNA高分靶位点筛选
•       2.2.2 gRNA退火
•       2.2.3 载体质粒pBOBI-Cas9-gRNA的线性化
•       2.2.4 重组质粒pBOBI-gRNA的构建与鉴定
•       2.2.5 慢病毒包装
•     2.3 结果
•       2.3.1 梅花鹿TGF-β1 基因的外显子预测
•       2.3.2 pBOBI-gRNA载体构建的测序结果
•       2.3.3 慢病毒包装结果
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 梅花鹿TGF-β1基因的敲除对鹿茸软骨细胞的影响
•     3.1 试验材料、试剂和仪器
•       3.1.1 材料
•       3.1.2 主要试剂
•       3.1.3 溶液配制
•       3.1.4 主要仪器
•     3.2 方法
•       3.2.1 鹿茸软骨细胞的原代培养
•       3.2.2 鹿茸软骨细胞的慢病毒感染
•       3.2.3 Western blot检测TGF-β1 蛋白的相对表达水平
•       3.2.4 EdU法检测TGF-β1 敲除对软骨细胞体外增殖的影响
•       3.2.5 细胞划痕检测TGF-β1 敲除对软骨细胞迁移的影响
•       3.2.6 PCR Array检测TGF-β1 敲除对通路相关基因表达的影响
•       3.2.7 荧光定量PCR检测通路相关基因的相对表达水平
•       3.2.8 Western Blot检测通路相关蛋白的表达情况
•     3.3 结果
•       3.3.1 总蛋白质含量的测定
•       3.3.2 梅花鹿TGF-β1 蛋白相对表达水平的检测
•       3.3.3 EdU检测TGF-β1 基因敲除对鹿茸软骨细胞增殖的影响
•       3.3.4 细胞划痕检测TGF-β1 基因敲除对鹿茸软骨细胞迁移的影响
•       3.3.5 鹿茸软骨细胞总RNA的质检
•       3.3.6 TGF-β1 基因敲除对软骨细胞中TGF-β通路相关基因表达的影响
•       3.3.7 荧光定量PCR检测通路相关基因的相对表达水平
•       3.3.8 Western Blot检测通路相关蛋白的表达水平
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘明晓

导师: 胡薇

关键词: 梅花鹿,转化生长因子,鹿茸软骨细胞

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 吉林农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000252

总页数: 74

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