两个三七病程相关蛋白基因的克隆及功能分析

论文摘要

三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]为五加科（Araliaceae）人参属（Panax）多年生草本植物,是我国传统名贵中药材。研究表明三七总皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇及提高机体免疫力等多种生物活性,是预防心脑血管疾病的重要药物。三七生长条件极为苛刻,其独特的生长环境易诱发病虫害的发生,尤其是真菌病害。其中根腐病已成为限制三七种植业发展的严重障碍,给三七的品质与产量带来了极大的影响。而导致根腐病的重要病原菌就是茄腐镰刀菌（Fusarium solani）。因此本论文通过对三七与茄腐镰刀菌的分子互作机制研究,发现一些三七抗病防卫基因,为三七的抗病遗传育种提供理论基础。前期研究发现,茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,Me JA）预处理三七,能够增加对三七对茄腐镰刀菌的抗性,通过对Me JA预处理后接种茄腐镰刀菌的三七进行转录组测序,发现病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins,PRs）基因能够同时响应外源Me JA的处理和茄腐镰刀菌的侵染。本研究通过快速扩增c DNA末端（rapid amplification of c DNA ends,RACE）技术克隆得到了两个响应Me JA处理和茄腐镰刀菌的侵染的三七病程相关基因Pn PR10-3与Pn PR like,并进一步分析了它们的表达特性及功能。1.利用RACE技术从三七中克隆得到一个PR10基因Pn PR10-3。Pn PR10-3全长c DNA序列为836 bp,其中开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）编码一个具有158个氨基酸的蛋白质,分子量大小为16.95 k Da。定量逆转录PCR（quantitative reverse transcriptase PCR,q RT-PCR）分析表明茄腐镰刀菌的侵染能够使Pn PR10-3基因的表达得到上调,且Me JA、乙烯（Ethylene,ETH）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）和水杨酸（salicylic acid,SA）四种信号分子的处理均能使Pn PR10-3的表达水平得到不同程度上调。Me JA处理72小时后,Pn PR10-3的表达量约为处理前的3倍;ETH处理48小时后,Pn PR10-3的表达量约为处理前的4倍;H2O2处理12小时后,Pn PR10-3的表达量约为处理前的6倍;SA处理24小时后,Pn PR10-3的表达量约为处理前的4.3倍。为进一步检测Pn PR10-3的活性,构建原核表达载体p ET-32a-Pn PR10-3,诱导得到重组蛋白。平板抑菌实验表明,重组蛋白对于尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄腐镰刀菌（F.solani）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和轮枝状镰刀菌（F.verticillioides）的生长存在明显的抑制效果,且蛋白浓度越高抑制效果越明显。核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase）活性测定结果表明Pn PR10-3重组蛋白具有体外RNase活性,大约为350 U mg-1。构建亚细胞定位载体p BIN m-gfp5-ER-Pn PR10-3,侵染洋葱表皮细胞,结果表明Pn PR10-3定位于细胞质。同时,构建植物超表达载体p CAMBIA2300S-Pn PR10-3,通过遗传转化获得T2代Pn PR10-3转基因烟草株系。QRT-PCR分析表明Pn PR10-3在T2代烟草中稳定表达,且转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显强于野生型烟草。进一步构建RNA干扰（RNA interference,RNAi）载体p Hellsgate2-Pn PR10-3,在三七叶片瞬时表达后接种茄腐镰刀菌,与对照相比,实验组三七叶片腐烂程度更严,表明p Hellsgate2-Pn PR10-3载体在三七叶片中的瞬时表达能降低三七叶片对茄腐镰刀菌的抗性。q RT-PCR发现p Hellsgate2-Pn PR10-3载体在三七叶片中的瞬时表达大幅度降低了Pn PR10-3基因在三七叶片中的转录水平。2.利用RACE技术从三七中克隆得到一个PR基因Pn PR like。Pn PR like全长c DNA序列为976 bp,其中ORF编码一个具有238个氨基酸的蛋白质,其蛋白质分子质量约为26.64 k Da。QRT-PCR分析表明茄腐镰刀菌的侵染能够使Pn PR like基因的表达得到上调,而且Me JA、SA、H2O2和ETH四种信号分子的处理均能使Pn PR like的表达水平不同程度上调。Me JA处理24小时后,Pn PR like的表达量约为处理前的5.2倍;SA处理24小时后,Pn PR like的表达量约为处理前的5倍;H2O2处理12小时后,Pn PR like的表达量约为处理前的3.2倍;ETH处理12小时后,Pn PR like的表达量约为处理前的2.4倍。为进一步检测Pn PR like的活性,构建原核表达载体p ET-32a-Pn PR like,诱导得到重组蛋白。平板抑菌实验表明,重组蛋白对于串珠状赤霉菌（Gibberella moniliformis）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和茄腐镰刀菌（F.solani）的生长存在明显的抑制效果,且蛋白浓度越高抑制效果越明显。RNase活性测定结果表明Pn PR like重组蛋白具有体外RNase活性,大约为325 U mg-1。亚细胞定位分析结果表明Pn PR like定位于细胞质。同时,构建植物超表达载体p CAMBIA2300S-Pn PR like,转化筛选得到T2代Pn PR like转基因烟草株系。QRT-PCR分析表明Pn PR like在T2代烟草中稳定表达,并且转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显强于野生型烟草。进一步构建RNAi载体p Hellsgate2-Pn PR like,在三七叶片瞬时表达后接种茄腐镰刀菌,与对照相比,实验组三七叶片腐烂程度更严,表明p Hellsgate2-Pn PR like载体在三七叶片中的瞬时表达能降低三七叶片对茄腐镰刀菌的抗性。q RT-PCR发现p Hellsgate2-Pn PR like载体在三七叶片中的瞬时表达大幅度降低了Pn PR like基因在三七叶片中的转录水平。综上所述,Pn PR10-3与Pn PR like响应茄腐镰刀菌的侵染,原核重组蛋白对茄腐镰刀菌等几种病原真菌具有明显的抑制活性。两个三七病程相关蛋白基因在烟草中过量表达增强了对茄腐镰刀菌的抗性,表明这两个基因在三七抵御茄腐镰刀菌的侵染中发挥着重要作用。

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摘要

Abstract

缩略词表

第一章绪论

1.1 三七根腐病简介

1.2 PR10 蛋白

1.3 PRs基因响应植物激素和逆境胁迫

1.3.1 响应植物激素诱导

1.3.2 受病原菌侵染的诱导

1.3.3 响应非生物胁迫

1.4 PR蛋白的抗真菌活性与抗性机制

1.4.1 PR蛋白的抗真菌活性

1.4.2 PR蛋白的抗真菌机制

1.5 三七病程相关蛋白的研究进展

1.6 本课题研究得目的及意义

第二章 PnPR10-3 基因的克隆及功能分析

2.1 前言

2.2 材料

2.2.1 植物及真菌材料

2.2.2 菌株和载体

2.2.3 主要试剂

2.2.4 缓冲液及培养基配方

2.3 方法

2.3.1 植物材料的处理及接种

2.3.2 RNA的提取及m RNA的分离

2.3.3 5′RACE

2.3.3.1 RACE引物的设计

2.3.3.2 RACE cDNA第一链的合成

2.3.3.3 RACE的扩增及T-A克隆

2.3.4 全长cDNA的克隆及生物信息学分析

2.3.5 qRT-PCR

2.3.6 PnPR10-3 的亚细胞定位

2.3.6.1 PnPR10-3 亚细胞定位载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 2.3.6.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

2.3.6.3 农杆菌转化洋葱表皮细胞

2.3.7 PnPR10-3 的原核表达、重组蛋白的抑菌活性分析及核糖核酸酶活性的测定

2.3.7.1 PnPR10-3 原核表达载体的构建

2.3.7.2 转化大肠杆菌

2.3.7.3 重组蛋白的诱导和纯化

2.3.7.4 重组蛋白的抑真菌活性分析

2.3.7.5 重组蛋白的体外核糖核酸酶活性测定

2.3.8 PnPR10-3 转基因烟草的获得及后代分析

2.3.8.1 植物超表达载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 2.3.8.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

2.3.8.3 转基因烟草的产生和筛选

2.3.8.4 PnPR10-3 转基因烟草株系的表达分析

2.3.8.5 T2代PnPR10-3 转基因烟草株系的抗病性分析

2.3.9 PnPR10-3 RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达及抗病性分析

2.3.9.1 RNAi载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 2.3.9.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

2.3.9.3 PnPR10-3 RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达及抗病性分析

2.3.9.4 RNAi载体在三七叶片瞬时表达后PnPR10-3 的表达水平分析

2.4 结果与分析

2.4.1 PnPR10-3 基因的全长c DNA及序列分析

2.4.2 PnPR10-3 基因的系统进化树

2.4.3 PnPR10-3 基因的表达谱分析

2.4.4 PnPR10-3 定位于细胞质

2.4.5 PnPR10-3 原核重组蛋白的诱导纯化及活性分析

2.4.6 PnPR10-3 转基因烟草的产生、筛选及分析

2.4.7 PnPR10-3 过表达转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显增强

2.4.8 pHellsgate2-PnPR10-3 在三七叶片中的瞬时表达减弱了三七叶片对茄腐镰刀菌的抗性

2.5 讨论

第三章 PnPR like基因的克隆及功能分析

3.1 前言

3.2 材料

3.2.1 植物及真菌材料

3.2.2 菌株和载体

3.2.3 主要试剂

3.2.4 缓冲液及培养基配方

3.3 方法

3.3.1 植物材料的处理及接种

3.3.2 RNA的提取及m RNA的分离

3.3.3 3′RACE

3.3.3.1 RACE引物的设计

3.3.3.2 RACE cDNA第一链的合成

3.3.3.3 RACE的扩增及T-A克隆

3.3.4 全长c DNA的克隆及生物信息学分析

3.3.5 qRT-PCR

3.3.6 PnPR like的亚细胞定位

3.3.6.1 PnPR like亚细胞定位载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 3.3.6.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

3.3.6.3 农杆菌转化洋葱表皮细胞

3.3.7 PnPR like的原核表达、重组蛋白的抑菌活性分析及核糖核酸酶活性的测定

3.3.7.1 PnPR like原核表达载体的构建

3.3.7.2 转化大肠杆菌

3.3.7.3 重组蛋白的诱导和纯化

3.3.7.4 重组蛋白的抑真菌活性分析

3.3.7.5 重组蛋白的体外核糖核酸酶活性测定

3.3.8 PnPR like转基因烟草的产生及分析

3.3.8.1 植物超表达载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 3.3.8.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

3.3.8.3 转基因烟草的产生和筛选

3.3.8.4 PnPR like转基因烟草株系的表达分析

3.3.8.5 T2代PnPR like转基因烟草株系的抗性分析

3.3.9 PnPR like RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达及分析

3.3.9.1 RNAi载体的构建

2 冻融法转化农杆菌感受态细胞'> 3.3.9.2 CaCl₂冻融法转化农杆菌感受态细胞

3.3.9.3 PnPR like RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达

3.3.9.4 RNAi载体在三七叶片瞬时表达后PnPR like的表达水平分析

3.4 结果与分析

3.4.1 PnPR like基因的全长c DNA及序列分析

3.4.2 PnPR like基因的系统进化树

3.4.3 PnPR like基因的表达谱分析

3.4.4 PnPR like定位于细胞质

3.4.5 PnPR like原核重组蛋白的诱导纯化及活性分析

3.4.6 PnPR like转基因烟草的产生、筛选及分析

3.4.7 PnPR like过表达转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显增强

3.4.8 pHellsgate2-PnPRlike在三七叶片中的瞬时表达减弱了三七叶片对茄腐镰刀菌的抗性

3.5 讨论

第四章结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录攻读硕士学位期间发表论文

申请的发明专利

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐笔锋

导师: 刘迪秋

关键词: 三七,病程相关蛋白,根腐病,茄腐镰刀菌,转基因烟草

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 昆明理工大学

基金: 国家自然科学基金项目“茉莉酸信号途径介导三七抗茄腐镰刀菌的分子机理研究”(81560610)

分类号: Q943.2;S567.236

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.000388

总页数: 96

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