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拟南芥蛋白激酶调控NADPH氧化酶RBOHF的机理研究

2020-12-02阅读(347)

拟南芥蛋白激酶调控NADPH氧化酶RBOHF的机理研究

论文摘要

在生物进化的过程中,Ca2+成为真核生物中重要的第二信使之一。在响应生物或非生物胁迫时,细胞质内Ca2+浓度会发生特异的时空变化,这种特异的变化被称之为Ca2+信号。为了响应这些特异的钙信号,植物体内逐步产生了大量的Ca2+感受器和效应器。拟南芥 calcineurin B-like（CBL）和 CBL interacting protein kinase（CIPK）是其中一类典型的Ca2+信号感知和解码蛋白复合物,调控了一系列下游蛋白的应激响应。近些年来,活性氧ROS也被发现是另一类重要的第二信使,尤其在植物免疫反应以及长距离信号转导中有关键作用。最近的研究表明,Ca2+信号通路与ROS信号通路之间存在着某种关联。本研究发现,拟南芥NADPH氧化酶RBOH是Ca2+信号和ROS信号的一个重要结合点。本研究通过生物化学、细胞生物学和遗传学等手段对CBL/CIPK调控RBOHF蛋白活性的分子机理进行了深入研究。本研究发现,在人肾胚（HEK）293T细胞异源表达系统中,CIPK26和CIPK11均能够与CBL1/9 一起激活RBOHF的活性。进一步分析发现,CIPK11和CIPK26对RBOHF的激活不存在协同效应,推测CIPK11和CIPK26可能在不同信号通路中起作用或者二者存在功能冗余。生化结果显示,CIPK11和CIPK26均在体外磷酸化RBOHF-N,而且施加Ca2+能够增强RBOHF-N的磷酸化强度。在HEK293T细胞中进行深入分析发现,RBOHF的激活依赖于CIPK26的激酶活性以及CBL1/CIPK26复合物的细胞膜定位;而RBOHF活性的进一步增强依赖于Ca2+对RBOHF的结合。因此,磷酸化和Ca2+的结合对RBOHF的激活是至关重要的,而且二者似乎能够互相增强彼此的功能。本研究还发现另一个重要的蛋白激酶open stomata 1（OST1/SnRK2.6）也能够在HEK293T细胞中调控RBOHF的活性。在HEK293T细胞中,对OST1的N端增加一个细胞膜定位的信号（PM）后发现,PM-OST1强烈地激活RBOHF。该发现表明OST1在细胞膜上的活性受到如蛋白间互作或者蛋白修饰等未知机制的调控。进一步研究发现,ABA信号通路中的OST1和Ca2+依赖的的CBL1/CIPK26在激活RBOHF上存在协同机制。质谱分析发现,CIPK26和OST1作用于RBOHF-N的位点存在异同。在HEK293T细胞中对这些位点的功能分析使得对RBOHF的调控机制能够进行深入的解析。最后,本研究发现蛋白磷酸酶PP2C家族成员ABI1强烈抑制CBL1/CIPK26和PM-OST1对RBOHF的激活,从而负调控RBOHF的活性。综上所述,我们的研究表明,在拟南芥NADPH氧化酶RBOHF被激活后,其介导的ROS生成能够在很短时间内迅速增强,而RBOHF的激活依赖于蛋白激酶的磷酸化以及Ca2+的结合。同时,我们也发现,RBOHF的活性不仅受到Ca2+依赖的多个蛋白激酶的调控,而且也受到Ca2+不依赖的蛋白激酶调控,从而揭示了 RBOHF调控机制的复杂性。根据本研究的结果,我们对RBOHF的复杂调控机制提出如下的模型:植物体在响应外界胁迫或者发育过程中的刺激信号时,快速形成的特异Ca2+信号能够通过Ca2+结合到RBOHF和Ca2+依赖的磷酸化在数秒或者数分钟内迅速的激活RBOHF;而经过较长时间合成的ABA能够激活OST1,从而增强和维持RBOHF介导的ROS生成。当胁迫或者刺激信号减弱时,ABA浓度的降低使ABI1的活性得到增强,ABI1去磷酸化RBOHF,从而抑制其功能。通过这种方式,RBOHF的磷酸化和去磷酸化得以平衡,使得植物体内ROS的生成得到精细的调控。RBOHF的这些复杂调控机制的生物学意义也会随着研究方法的不断改进而被逐步揭示,而这些机制对于研究其它NADPH氧化酶的调控也有重要的参考价值。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 植物细胞信号转导机理
  •   1.2 植物钙信号的研究进展
  •     1.2.1 钙信号的提出
  • 2+信号的解码机制'>    1.2.2 Ca2+信号的解码机制
  •     1.2.3 CBL/CIPK调控网络的功能和机理
  •     1.2.4 蛋白磷酸酶PP2C负调控CBL/CIPK信号通路
  •     1.2.5 CBL/CIPK调控网络的保守性
  • 2+信号与活性氧信号的互作'>  1.3 Ca2+信号与活性氧信号的互作
  •   1.4 活性氧ROS信号的研究进展
  •     1.4.1 植物RBOHs介导并调控信号分子ROS的生成
  •     1.4.2 ROS的清除和平衡机制
  •   1.5 NADPH氧化酶RBOHs的生理功能
  •     1.5.1 RBOHs在植物细胞生长和发育中的功能
  •     1.5.2 RBOHs在响应植物非生物胁迫中的功能
  •     1.5.3 RBOHs在植物免疫中的功能
  •   1.6 RBOHs分子调控机制的研究进展
  • 2+调控'>    1.6.1 RBOHs的活性受到Ca2+调控
  •     1.6.2 RBOHs的活性受到多种激酶的磷酸化调控
  •     1.6.3 RBOHs的活性受到14-3-3蛋白的调控
  •     1.6.4 RBOHs的活性受到ROP和巯基亚硝酸化的调控
  • 2+和ROS的长距离信号转导'>  1.7 Ca2+和ROS的长距离信号转导
  •     1.7.1 ROS信号的长距离转导
  • 2+信号的长距离转导'>    1.7.2 Ca2+信号的长距离转导
  • 2+长距离信号转导的交叉互作'>    1.7.3 ROS和Ca2+长距离信号转导的交叉互作
  •   1.8 本研究的目的和意义
  • 第二章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 菌株
  •   2.2 载体和引物
  •     2.2.1 载体
  •     2.2.2 载体构建信息
  •     2.2.3 相关引物
  •   2.3 酶和试剂
  •   2.4 主要实验仪器
  •   2.5 常用培养基及试剂的配制
  •   2.6 实验方法
  •     2.6.1 拟南芥的培养
  •     2.6.2 土壤中生长的拟南芥的盐胁迫处理实验
  •     2.6.3 液体培养的拟南芥的盐胁迫处理和Na含量检测实验
  •     2.6.4 载体的构建
  •     2.6.5 拟南芥转基因材料的获得
  •     2.6.6 拟南芥的PI染色以及中柱内PI吸收的定量分析
  •     2.6.7 重组蛋白的表达及纯化
  •     2.6.8 本生烟叶片中的总蛋白提取
  •     2.6.9 蛋白免疫印迹
  •     2.6.10 体外磷酸化实验
  •     2.6.11 拟南芥总RNA的提取和反转录
  •     2.6.12 实时定量PCR
  •     2.6.13 本生烟叶片中的ROS生成检测
  •     2.6.14 HEK293T细胞的转染和ROS的检测
  • 第三章 结果与分析
  •   3.1 RBOHF的活性受到CBL/CIPK复合物的调控
  •     3.1.1 CIPKI1和CIPK26在HEK293T细胞中强烈激活RBOHF
  •     3.1.2 CIPK11在体外磷酸化RBOHF-N
  •     3.1.3 CIPK11和CIPK26对RBOHF的激活没有协同效应
  •     3.1.4 CBL1/CIPK26对RBOHF活性的增强依赖于激酶的活性以及复合物的细胞膜定位
  • 2+的调控'>  3.2 RBOHF的活性受到Ca2+的调控
  • 2+的结合'>    3.2.1 RBOHF蛋白活性的增强依赖于Ca2+的结合
  • 2+能够在体外增强CIPK26对RBOHF-N的磷酸化'>    3.2.2 Ca2+能够在体外增强CIPK26对RBOHF-N的磷酸化
  •   3.3 CBL1/CIPK26复合物在本生烟叶片中增强RBOHF的活性
  •   3.4 RBOHF相关基因的突变体表型分析
  •     3.4.1 RBOHF和CBL4作用于不同的盐胁迫响应通路中
  •     3.4.2 RBOHF调控通路中的相关基因的表型分析
  • 2+能够影响拟南芥根部的发育'>    3.4.3 Ca2+能够影响拟南芥根部的发育
  •   3.5 OST1通过磷酸化强烈激活RBOHF
  •     3.5.1 PM-OST1在HEK293T细胞中激活RBOHF
  • 2+的结合有助于增强PM-OST1对RBOHF的激活'>    3.5.2 Ca2+的结合有助于增强PM-OST1对RBOHF的激活
  •     3.5.3 OST1突变体的表型分析
  •     3.5.4 CBL1/CIPK26和PM-OST1协同增强RBOHF的活性
  •     3.5.5 CIPK26作用于RBOHF的三个丝氨酸位点
  •   3.6 RBOHF的磷酸化位点在植物体内的功能分析
  •   3.7 RBOHF的磷酸化位点在HEK293T细胞中的功能分析
  •     3.7.1 RBOHF磷酸化位点的突变抑制了CBL1/CIPK26对RBOHF的激活
  •     3.7.2 RBOHF磷酸化位点的突变减弱了PM-OST1对RBOHF的激活
  •     3.7.3 RBOHF磷酸化位点的突变抑制了CBL1/CIPK26和PM-OST1对RBOHF的协同激活
  •   3.8 ABI1负调控RBOHF的活性
  •     3.8.1 ABI1抑制PM-OST1对RBOHF的激活
  •     3.8.2 ABI1抑制CBL1/CIPK26对RBOHF的激活
  •     3.8.3 ABI1抑制CBL1/CIPK26和PM-OST1对RBOHF的协同激活
  • 第四章 讨论与展望
  •   4.1 多个CIPK蛋白激酶调控RBOHF活性的机制探讨
  • 2+结合和磷酸化调控机制的探讨'>  4.2 RBOHF的Ca2+结合和磷酸化调控机制的探讨
  •   4.3 CBL1/CIPK26和OST1协同调控RBOHF活性的机制探讨
  •   4.4 ABI1负调控CBL1/CIPK26和OST1对RBOHF激活的机制探讨
  •   4.5 拟南芥通过复杂的机制精细调控RBOHF的活性
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 韩建普

    导师: 武维华,J(?)rg Kudla,王毅

    关键词: 拟南芥,氧化酶

    来源: 中国农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 中国农业大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 122

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