人脂肪干细胞来源外泌体促进脂肪干细胞成骨分化的作用研究

论文摘要

目的:提取并鉴定人脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells,ADSCs）不同成骨分化阶段的外泌体（hADSC-Exos）,探究hADSC-Exos促进成骨分化的适宜提取时间及作用浓度,证明其能够进入hADSCs内进行调控。研究方法:酶消化法分离培养原代hADSCs并进行鉴定;超速离心法提取hADSCs未成骨诱导（Exo0）,成骨诱导114d（Exo14）及1528d（Exo28）的外泌体,并采用透射电镜,Western Blot,动态光散射法进行鉴定;使用茜素红染色检测比较3种hADSC-Exos促进原始hADSCs成骨分化的能力;PKH67标记Exo14检测hADSCs对其摄取的能力;CCK-8和划痕法分别检测三种不同浓度（10、15、20μg/ml）Exo14对hADSCs增殖及迁移能力的影响;Western Blot检测不同浓度Exo14对hADSCs成骨相关蛋白表达的作用。结果:实验所获取的hADSCs符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及动态光散射结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征,Western Blot检测外泌体CD63,CD9呈阳性表达。茜素红染色表明培养21d后,Exo14组矿化结节含量明显高于Exo28组。PKH67标记的外泌体能够被hADSCs摄取进入细胞,聚集在细胞核周围。CCK-8表明培养24h,48h外泌体对细胞增殖能力无影响,至72h,15μg/mlExo14明显促进hADSCs增殖;划痕实验表明培养至12h外泌体组明显高于阴性对照PM组（P<0.01）,且随外泌体浓度增加促细胞迁移能力呈递减趋势但统计学分析无意义（P>0.05）。Western Blot检测共培养3d,Exo14组成骨相关蛋白ALP,RUNX2呈阳性表达,结果表示15μg/mlExo14组促RUNX2表达能力与成骨诱导液组（阳性对照组）相当,蛋白表达明显高于10μg/mlExo14组（0.583±0.045）和20μg/mlExo14（0.499±0.010）。结论:hADSCs成骨诱导114d分泌的外泌体Exo14能够被原始的hADSCs高效摄取并且进入细胞内独立作用诱导hADSCs成骨分化。较低浓度的Exo14即可促进hADSCs增殖,迁移,成骨分化,并且最适宜作用浓度为15μg/ml。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 1 前言
• 2 材料及方法
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 主要试剂
•     2.1.2 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 hADSCs提取与培养
•     2.2.2 流式细胞仪检测hADSCs表面分子标志物
•     2.2.3 ADSCs多向分化能力鉴定
•     2.2.4 超速离心法提取hADSCs-Exos
•     2.2.5 透射电镜鉴定外泌体形态
•     2.2.6 动态光散射分析外泌体粒径
•     2.2.7 蛋白印迹法检测外泌体表面分子标志
•     2.2.8 不同时间外泌体与hADSCs共培养
•     2.2.9 茜素红染色及半定量含钙测定
•     2.2.10 hADSCs摄取PKH67 标记外泌体
•     2.2.11 不同浓度的外泌体与hADSCs共培养
•     2.2.12 CCK-8 法检测hADSCs增殖能力
•     2.2.13 划痕法检测ADSCs迁移能力
•     2.2.14 碱性磷酸酶染色（BCIP/NBT法）
•     2.2.15 碱性磷酸酶（ALP）活性检测
•     2.2.16 成骨相关蛋白检测
•     2.2.17 统计学分析
• 3 实验结果
•   3.1 hADSCs形态学观察
•   3.2 hADSCs表面分子标志物鉴定
•   3.3 hADSCs多向分化能力鉴定
•   3.4 hADSCs-Exos电镜鉴定
•   3.5 hADSCs-Exos粒径分析
•   3.6 hADSCs-Exos表面标志物分子鉴定
•   3.7 不同分化阶段分泌的ADSCs-Exos对 ADSCs成骨矿化的影响
•   3.8 hADSCs摄取PKH67 标记的hADSCs-Exos
•   3.9 不同浓度hADSCs-Exos对细胞增殖能力的影响
•   3.10 不同浓度外泌体对细胞迁移能力的影响
•   3.11 ALP染色及活性检测
•   3.12 Western Blot检测成骨相关蛋白表达
• 4 讨论
• 5 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱梦茹

导师: 郭澍

关键词: 人脂肪干细胞,外泌体,成骨分化,骨组织工程

来源: 中国医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国医科大学

基金: 国家自然科学基金(51272286),国家卫计委公益性行业科研专项(2015SQ00049),辽宁省自然科学基金(20102296)

分类号: R329.2

DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.001189

总页数: 52

文件大小: 2630K

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