来源于苜蓿链霉菌的糖苷水解酶19家族几丁质酶的性质研究与应用

论文摘要

几丁质酶是一种作用于几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺和几丁寡糖的水解酶,可用于几丁质的生物转化和生物防治植物病原真菌病害。本实验室在生物菌肥苜蓿链霉菌ACCC40021全基因组测序及CAZy分析的基础上,发现其存在唯一的糖苷水解酶19（GH19）家族的几丁质酶SaChi19B。本课题研究了该几丁质酶的酶学性质,并评估了其在几丁质生物转化和生物防治植物病原真菌的效率;利用蛋白质工程技术,进一步提高了其抗植物病原真菌的作用。1、本研究对该GH19几丁质酶基因进行了克隆,并在E.coli BL21（DE3）中高效表达。SaChi19B的最适pH为8.0（磷酸缓冲液）,最适温度为45℃,具有良好的pH和温度稳定性;通过底物特异性试验表明,其具有广泛的底物谱,对乙二醇几丁质、胶体几丁质和α-几丁质有较高的活性;通过SaChi19B作用方式的TLC分析表明:其属于内切几丁质酶;通过SaChi19B和SaHEX协同作用于虾壳几丁质试验表明,其在8小时达到最大转化率,GlcNAc产率为95.19%,纯度大于98%;通过抗植物病原真菌试验表明,SaChi19B对6种主要的植物病原真菌均有抑制作用,对灰葡萄孢、立枯丝核菌抑制最强。以上结果首次证明GH19几丁酶可作为生物催化剂,用于转化晶体几丁质;同时,该几丁质酶可作为生防制剂,应用于防治植物真菌病害。2、为了探索一种简单有效的提高几丁质酶SaChi19B的活性及抗真菌活性的策略,我们成功构建了CatDChi19B（仅有催化结构域）、rChi19B（含N-端几丁质结合结构域）、DChBDChi19B（含两端几丁质结合结构域）三种形式的酶,并在E.coli BL21（DE3）中得到了高效表达;与CatDChi19B和rChi19B相比,DChBDChi19B显著地提高了对α-几丁质、胶体几丁质和黑曲霉几丁质的结合能力和活性;同时增强了其对病原真菌长枝木霉的抑制作用,证明了简单的两端融合表达ChBD能够显著地增强几丁质酶对不同几丁质的活性和抗真菌活性。3、为了进一步提高几丁质酶SaChi19B抗真菌活性和广谱性,我们通过无缝克隆的方法在SaChi19B的C端融合壳聚糖酶SaCsn,成功构建了融合酶SaChi19B-Csn,并在E.coli BL21（DE3）中得到了高效表达。融合酶SaChi19B-Csn的最适温度为30℃,最适pH为8.0（磷酸缓冲液）;通过底物特异性试验表明:该酶显示出广泛的底物谱,尤其是对几丁质和壳聚糖具有较高活性。抗真菌试验表明:SaChi19B-Csn与原始的几丁质酶SaChi19B相比,不仅提高了对所有测试的植物致病真菌的效率,而且扩大了抗真菌谱。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 引言
•   1.1 几丁质酶及其功能
•   1.2 几丁质酶的分类
•   1.3 几丁质酶的结构
•   1.4 几丁质酶的研究与应用——几丁质的生物转化
•     1.4.1 几丁质及其降解产物
•     1.4.2 降解几丁质的研究
•     1.4.3 自然界中几丁质的降解
•     1.4.4 几丁质酶降解几丁质的研究
•   1.5 几丁质酶的研究与应用——防治植物病原真菌
•     1.5.1 植物病原真菌的危害
•     1.5.2 植物病原真菌的细胞壁组成
•     1.5.3 几丁质酶作为生物防治手段的必要性及有效性
•     1.5.4 微生物几丁质酶在生物防治病原真菌中的应用
•   1.6 本课题的研究背景
•     1.6.1 苜蓿链霉菌ACCC40021（Streptomyces alfalfae ACCC40021）的研究现状
•     1.6.2 本研究的目的意义
• 2 几丁质酶SaChi19B的克隆表达及酶学性质的研究和应用
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 培养基及相关溶液
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要仪器
•     2.1.5 引物合成
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 S.alfalae ACCC40021 基因组的提取
•     2.2.2 几丁质酶SaChi19B基因的克隆
•     2.2.3 pET30a（+）-SaChi19B的构建
•     2.2.4 pET30a（+）-SaChi19B连接产物的转化及双酶切验证阳性克隆
•     2.2.5 几丁质酶SaChi19B的原核表达及纯化
•     2.2.6 几丁质酶SaChi19B的活性测定和蛋白浓度的测定
•     2.2.7 GlcNAc标准曲线的绘制
•     2.2.8 SDS-PAGE和活性染色分析
•     2.2.9 几丁质酶SaChi19B酶学性质分析
•     2.2.10 SaChi19B对不溶性底物的结合试验
•     2.2.11 底物特异性分析和酶动力学参数的测定
•     2.2.12 抗真菌试验
•     2.2.13 SaChi19B作用方式的TLC分析
•     2.2.14 SaChi19B与 Sa HEX水解虾壳蟹壳来源的晶体几丁质产生Glc NAc的反应
•     2.2.15 数据分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 几丁质酶SaChi19B的克隆和序列分析
•     2.3.2 GlcNAc标准曲线的绘制
•     2.3.3 几丁质酶SaChi19B的表达和纯化
•     2.3.4 几丁质酶SaChi19B的酶学性质分析
•     2.3.5 SaChi19B的对不溶性底物的结合试验
•     2.3.6 几丁质酶SaChi19B的底物谱及动力学参数
•     2.3.7 SaChi19B作用方式的TLC分析
•     2.3.8 几丁质酶SaChi19B的抗真菌活性
•     2.3.9 SaChi19B与 SaHEX水解虾壳蟹壳来源的结晶几丁质产生GlcNAc的反应
•   2.4 讨论
• 3 两端融合表达几丁质结合结构域提高几丁质酶抗真菌活性
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 试验所用菌株
•     3.1.2 培养基及相关溶液
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 黑曲霉几丁质的制备
• Chi19B、pET-30a（+）-rChi19B和 pET-30a（+）-DChBD_Chi19B的构建'>    3.1.5 pET-30a（+）-CatD_Chi19B、pET-30a（+）-rChi19B和 pET-30a（+）-DChBD_Chi19B的构建
•     3.1.6 重组几丁质酶的原核表达及纯化
•     3.1.7 几丁质酶的活性测定和蛋白浓度的测定
•     3.1.8 重组几丁质酶对不同几丁质的活性
•     3.1.9 重组几丁质酶对不溶性底物结合能力分析
•     3.1.10 抗真菌试验
•     3.1.11 数据分析
•   3.2 结果和分析
•     3.2.1 重组几丁质酶的构建及原核表达
•     3.2.2 重组几丁质酶对不溶性底物结合能力分析
•     3.2.3 重组几丁质酶对不同几丁质的活性
•     3.2.4 抗真菌活性
•   3.3 讨论
• 4 通过融合壳聚糖酶以增强细菌GH19 家族几丁质酶的抗真菌活性
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 菌株
•     4.1.2 培养基及相关溶液
•     4.1.3 主要试剂
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 无缝克隆构建融合酶基因SaChi19B-Csn
•     4.2.2 SaChi19B-Csn的原核表达及纯化
•     4.2.3 融合酶SaChi19B的活性测定和蛋白浓度的测定
•     4.2.4 SDS-PAGE和活性染色分析
•     4.2.5 SaChi19B-Csn的酶学性质分析
•     4.2.6 SaChi19B-Csn底物特异性分析和酶动力学参数的测定
•     4.2.7 抗真菌活性
•     4.2.8 数据分析
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 融合酶SaChi19B-Csn的克隆及序列、结构分析
•     4.3.2 融合酶的表达和纯化
•     4.3.3 SaChi19B-Csn的酶学性质分析
•     4.3.4 SaChi19B-Csn底物特异性分析和酶动力学参数的测定
•     4.3.5 SaChi19B-Csn的抗真菌试验
•   4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谷天燕

导师: 赵国刚

关键词: 几丁质,几丁质酶,生物转化,乙酰葡萄糖胺,植物病原真菌,生防制剂

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 河北农业大学

分类号: S432.44

DOI: 10.27109/d.cnki.ghbnu.2019.000189

总页数: 70

文件大小: 1953K

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