拟南芥CNGC2蛋白的胞吞及其在抗病中的作用

论文摘要

生物在进化的过程中,形成了包括离子通道、离子泵和载体等复杂的营养吸收以及转运系统。在前期,学者们已经做了大量工作来了解这些通道蛋白的分子性质和功能。近年来,基于电生理学和异源表达分析的实验证明,植物环核苷酸门控通道（cyclic nucleotide-gated channel,CNGC）的作用是非选择性阳离子通道。植物CNGCs是一个相对较大的基因家族,目前已经在大麦（Hordeum vulgrare）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）等多种植物中发现了CNGC,但对于CNGCs的功能尚不完全清楚。CNGC2作为植物CNGCs基因家族中第Ⅳ家族B亚组的成员,目前尚缺乏对该蛋白胞吞过程的研究,对于其是否参与植物抗病还需要进一步的探讨。本研究在克隆了拟南芥CNGC2基因,构建35S::AtCNGC2-GFP融合表达载体的基础上,取得了 CNGC2-GFP转基因拟南芥植株。通过可变角度全内反射荧光显微（variable angle-total internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM）,荧光寿命和荧光共振能量转移（fluorescence lifetime imaging,and Forster resonance energy transfer,FLIM-FRET）,荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy,FCS）以及荧光互相关光谱（fluorescencecoss-correlationspectroscopy,FCCS）等技术,结合分子生物学的研究方法,对拟南芥CNGC2-GFP在质膜上的分布、运动模式、胞吞以及该蛋白在植物抗病中的作用进行了研究。主要结果如下:（1）胼胝质沉积实验发现,在使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理激活后,与野生型相比,突变体cngc2中出现大量胼胝质的累积。根据该实验结果推测CNGC2与植物抗病相关。（2）运用VA-TIRFM技术,对拟南芥幼苗叶表皮细胞CNGC2动态特征进行了分析,结果发现CNGC2在质膜上分布不均匀,利用MATLAB软件分析后发现,CNGC2存在四种运动模式,其中定向运动为主要运动模式。（3）在使用放线菌酮（cycloheximid,CHX）抑制了胞内新蛋白合成的情况下,用布雷菲德菌素（brefeldin A,BFA）结合FM4-64处理拟南芥幼苗发现,CNGC2-GFP会在胞质内形成BFA小体,说明在静息状态下CNGC2存在组成型胞吞。运用LPS处理后,拟南芥表皮细胞中会出现胞吞小泡,并且通过FCS技术检测发现细胞膜上CNGC2蛋白分子密度减少。说明在激活状态下,活化了的CNGC2蛋白运动加快,CNGC2存在配体诱导型胞吞。（4）抑制剂处理实验表明,Clathrin参与调控CNGC2的胞吞过程。Clathrin抑制剂TyrA23能抑制CNGC2的胞吞和蛋白降解。该结果说明,膜微区介导的蛋白质胞吞途径参与CNGC2的胞吞。应用固醇抽提剂MβCD（methyl-β-cyclodextrin）处理拟南芥幼苗后观察发现,MβCD导致CNGC2-GFP的胞吞受到抑制,暗示富含固醇的膜结构参与了 CNGC2的胞吞。（5）运用非损伤微测技术（non-invasive micro-test technique,NMT）,分别对 LPS处理激活后,过表达材料CNGC2、野生型WT以及突变体cngc2中Ca2+流的情况进行检测。随后,分别对野生型以及突变体,在LPS处理后的抗病相关基因的表达情况进行了检测。结果发现:在突变体中分别表现出Ca2+内流量减小以及抗病相关基因表达量上调等现象。此外,结合FCCS技术以及FLIM-FRET技术,可以检测到CNGC2-GFP与CaM-mCherry之间存在相互作用,且在LPS处理后,二者的相互作用增强。以上结果表明CNGC2-GFP参与植物抗病。综上所述,本研究利用高时空分辨率的荧光成像技术,结合分子生物学的研究手段,对CNGC2蛋白的动态特征及胞吞过程进行了分析。研究揭示:CNGC2蛋白在细胞质膜上的运动是高度动态的;CNGC2蛋白存在多种胞吞途径,其中clathrin介导的胞吞途径在CNGC2-GFP的胞吞过程中起到重要作用,并且膜微区也参与了质膜上CNGC2-GFP的胞吞;通过对Ca2+流量、抗病相关基因的表达情况,以及CNGC2蛋白与钙调素蛋白CaM4之间的关系进行的研究表明,CNGC2参与植物抗病。这些结果为进一步揭示CNGC2的胞吞途径,阐明CNGC2参与植物抗病的机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 1 引言
•   1.1 植物CNGC家族的种类和分布
•   1.2 植物CNGC的结构研究
•   1.3 CNGC的作用机制及其调节因子
•     1.3.1 CNGC的作用机制
•     1.3.2 CNGC的调控因子
•       1.3.2.1 cAMP
• 2+/CaM'>      1.3.2.2 Ca²⁺/CaM
•   1.4 CNGC与植物免疫反应
•     1.4.1 植物的免疫反应
•     1.4.2 CNGC参与植物的免疫反应
•     1.4.3 CNGC与SA信号途径
•     1.4.4 CNGC与HR和R基因介导抗性的关系
•     1.4.5 CNGC中茉莉酸/乙烯信号的变化
•     1.4.6 CNGC2与超敏反应之间的关系
•     1.4.7 其他与防御反应相关的CNGCs
•   1.5 单分子技术在活体细胞中的应用
•     1.5.1 FLIM-FRET技术的原理及应用
•     1.5.2 全内反射荧光显微术
•     1.5.3 荧光相关光谱技术在活体细胞中的应用
•   1.6 本研究的意义和研究内容
• 2 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株
•     2.1.3 质粒
•     2.1.4 试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥种子的消毒以及培养
•     2.2.2 拟南芥总RNA的提取
•     2.2.3 cDNA的合成
•     2.2.4 拟南芥基因组DNA的提取
•     2.2.5 荧光定量PCR
•     2.2.6 VA-TIRFM图像采集及处理
•     2.2.7 单分子追踪与分析
•     2.2.8 激光扫描共聚焦显微镜观察
•     2.2.9 农杆菌感受态的制备
•     2.2.10 拟南芥植株的杂交
•     2.2.11 质粒的提取
•     2.2.12 琼脂糖凝胶DNA的回收
•     2.2.13 胼胝质染色
•     2.2.14 FLIM-FRET
•     2.2.15 FCS检测与分析
• 3 实验结果与分析
•   3.1 胼胝质染色分析
•     3.1.1 胼胝质沉积实验
•     3.1.2 本节小结
•   3.2 CNGC2-GFP的细胞质膜定位及运动模式分析
•     3.2.1 CNGC2-GFP在细胞质膜上的定位分析
•     3.2.2 CNGC2-GFP在质膜上的分布
•     3.2.3 CNGC2-GFP在质膜上的运动模式分析
•     3.2.4 本节小结
•   3.3 CNGC2的胞吞作用
•     3.3.1 CNGC2-GFP的组成型胞吞
•     3.3.2 CNGC2-GFP的诱导型胞吞
•     3.3.3 本节小结
•   3.4 CNGC2胞吞途径的研究
•     3.4.1 网格蛋白对CNGC2胞吞过程的影响
•     3.4.2 膜微区参与调控CNGC2的胞吞过程
•     3.4.3 网格蛋白及膜微区参与CNGC2的诱导型胞吞
•     3.4.4 本节小结
•   3.5 抗病相关基因的表达量变化
•     3.5.1 抗病相关基因的表达量变化的检测
•     3.5.2 本节小结
•   3.6 CNGC2与CAM4之间的相互作用情况
•     3.6.1 FLIM-FRET检测CNGC2与CaM4之间的相互作用
•     3.6.2 FCCS检测CNGC2与CaM4之间的相互作用
•     3.6.3 本节小结
•   3.7 处理激活下钙离子流的变化情况
•     3.7.1 非损伤微测技术检测钙离子流的变化情况
•     3.7.2 本节小结
• 4 讨论及展望
• 5 结论
• 参考文献
• 导师简介1
• 导师简介2
• 个人简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董紫怡

导师: 林金星,李瑞丽

关键词: 拟南芥,胞吞,膜微区,动力学行为

来源: 北京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京林业大学

分类号: Q945

DOI: 10.26949/d.cnki.gblyu.2019.000351

总页数: 67

文件大小: 4949K

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