蓬松蛋白的DNA甲基化修饰调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

论文摘要

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）在机体内具有潜在的多方向分化能力,可作为种子细胞参与生物体的组织构建与再生,然而怎样调控骨髓间充质干细胞向特定的功能细胞分化仍然存在许多不确定因素,只有充分阐明间骨髓充质干细胞诱导分化明确的分子调节机制,才能对其的诱导分化方向进行特定性地干预。研究表明转录调节因子是现阶段传统的调控手段,其中表观遗传修饰在骨髓间充质干细胞诱导分化调控的进程中起着至关重要的作用,研究中常用的表观遗传方式的调控主要是蛋白DNA的甲基化修饰。蓬松蛋白（Dishevelled）是涉及典型和非典型Wnt信号通路的蛋白质家族。蓬松蛋白是直接作用于卷曲受体下游的细胞质磷蛋白,其在胚胎和成年人之间都发挥重要作用,影响着从细胞分化和细胞极性到社会行为的整个过程。研究目的:本论文通过构建人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化模型,利用特异性的DNA甲基化抑制剂（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶）来研究蓬松蛋白中DNA启动子区CpG岛的甲基化修饰对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的进程影响和调控作用,并探讨甲基化修饰对差异表达性基因表达水平的影响。研究方法:1、骨髓间充质干细胞在成骨培养基中诱导分化,利用细胞染色剂茜素红鉴定其成骨分化程度,AKP试剂盒检测成骨分化过程中碱性磷酸酶的活性和表达量。利用RT-PCR和蛋白免疫法检测诱导分化过程中蓬松蛋白的表达水平。2、应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测骨髓间充质干细胞成骨诱导分化前后蓬松蛋白DNA启动子区CpG岛甲基化程度。3、应用RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测甲基转移酶抑制剂（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶）处理前后Wnt、GSK3、Axin、Dishevelled、β-catenin的表达水平。4、利用甲基化转移酶对蓬松蛋白启动子CpG岛进行甲基化后,对转录了甲基化启动子的骨髓间充质干细胞进行高通量测序分析差异性表达基因的表达水平。5、加入甲基转移酶抑制剂（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶）处理骨髓间充质干细胞,RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测差异基因随分化天数变化的表达情况。6、设计合成差异基因的增强子（mimics）和抑制子（inhibitors）,并将其转染至骨髓间充质干细胞中,利用RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测差异基因的表达水平,利用茜素红染色鉴定转染后的干细胞成骨分化程度。研究结果:1、随着诱导分化骨髓间充质干细胞的时间增长,其成骨分化的程度越来越大,同时碱性磷酸酶和蓬松蛋白的表达量也呈上升的趋势。2、在诱导分化7、14、21天后,骨髓间充质干细胞中蓬松蛋白启动子区域CpG岛甲基化程度随着诱导分化的进行而降低。3、在加入甲基化酶抑制剂（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶）共同作用于成骨分化的骨髓间充质干细胞后,相对于DMSO实验对照组,随着诱导分化时间的增加,Wnt、GSK3、Axin、Dishevelled、β-catenin的表达水平都呈上升趋势。4、通过对甲基化启动子转染的骨髓间充质干细胞进行高通量分析后,发现PP2A在分化的细胞中表达异常,通过调控表达实验进一步证实,过表达差异基因PP2A能够促进骨髓间充质干细胞的分化进程。结论:本论文充分证明了蓬松蛋白中DNA启动子区CpG岛的甲基化修饰程度对骨髓间充质干细胞的分化具有调节和控制的作用,我们借助调节干细胞内的差异化基因PP2A的表达水平,来调节骨髓干细胞分化的进程,这可为骨髓间充质干细胞在成骨诱导分化的研究和应用提供了重要依据和实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 前言
•   参考文献
• 第一章 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化及相关蛋白的表达
•   引言
•   1.1 材料和仪器
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 骨髓间充质干细胞的成骨分化
•     1.2.2 骨髓间充质干细胞在成骨分化中蓬松蛋白的表达
•     1.2.3 骨髓间充质干细胞成骨分化中蓬松蛋白基因启动子区域的甲基化
•     1.2.4 甲基化酶抑制剂诱导前后信号因子表达水平评价
•     1.2.5 统计学分析
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 骨髓间充质干细胞的分化与鉴定
•     1.3.2 骨髓间充质干细胞中蓬松蛋白的表达
•     1.3.3 骨髓间充质干细胞中蓬松蛋白启动子区域甲基化
•     1.3.4 相关信号因子的表达水平检测
•   1.4 讨论
•   1.5 结论
•   参考文献
• 第二章 蓬松蛋白DNA甲基化修饰在成骨分化过程中的调控作用
•   引言
•   2.1 材料和仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 甲基化修饰后骨髓间充质干细胞差异表达基因
•     2.2.2 差异基因PP2A在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达变化
•     2.2.3 过表达和抑制表达差异基因PP2A对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
•     2.2.4 细胞活力鉴定、RT-PCR和蛋白免疫印迹分析
•     2.2.5 统计学分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 差异表达基因PP2A的鉴定
•     2.3.2 差异基因PP2A在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达变化
•     2.3.3 过表达和抑制表达差异基因PP2A对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
•   2.4 讨论
•   2.5 结论
•   参考文献
• 第三章 全文总结与讨论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 韩晓峰

导师: 刘祖德

关键词: 氮胞苷,骨髓间充质干细胞,成骨分化,甲基化

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 上海交通大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000705

总页数: 68

文件大小: 2007K

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