导读:本文包含了奶山羊乳腺上皮细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:山羊乳腺上皮细胞(GMECs),脂肪酸去饱和酶2基因(FADS2),克隆,siRNA
奶山羊乳腺上皮细胞论文文献综述
邬娇,赫秋亚,李壮,李聪,王会[1]（2019）在《干扰FADS2基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响》一文中研究指出脂肪酸去饱和酶2 (fatty acid desaturation 2, FADS2)作为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)如花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等合成过程中的限速酶,可在脂肪酸链的第6、7位将其底物脱氢形成双键。本研究以原代奶山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞(goats mammary epithelial cells, GMECs)为材料,利用PCR及siRNA介导的干扰技术研究奶山羊FADS2的生物学特性及功能。本实验克隆得到FADS2基因(GenBank No. MK292654)的CDS区为1 335 bp,编码444个氨基酸,与绵羊(Ovis aries, XM_015103138.2)和牛(Bos taurus, NM_001083444.1)具有高度同源性;利用siRNA介导的干扰技术,在GMECs中转染si-FADS2时,FADS2自身mRNA水平下调60%～70%(P<0.01),同时蛋白水平下降15%～18%(P<0.05);干扰FADS2,显着上调与多不饱和脂肪酸合成相关的基因超长链脂肪酸延伸酶2基因(elongase of very long chain fatty acids 2, ELOVL2)、ELOVL6 (P<0.01)和脂肪酸去饱和酶1基因(fatty acid desaturation 1, FADS1)(P<0.05)表达;同时促进转录因子固醇调节元件结合蛋白1a基因(sterol regulatory element-binding transcription protein, SREBP1a)(P<0.01)、从头合成相关基因脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase, FASA)和乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase, ACACA)及硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因(stearoyl-CoA desaturase1, SCD1)的表达(P<0.05);干扰FADS2,显着降低细胞中AA及DHA比例(P<0.05),导致细胞中PUFAs含量降低;并且抑制二酰基甘油转移酶基因1 (diacylglycerol acyltransferase 1, DGAT1)(P<0.01)及DGAT2 (P<0.05)表达,降低细胞中甘油叁酯(triacylglyceride, TAG)(P<0.05)含量。因此,FADS2具有调控奶山羊乳腺PUFAs合成及甘油叁酯代谢的重要功能。本研究为羊奶PUFAs代谢研究提供了实验依据。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2019年11期）
李君,梁文双,赫秋亚,杨芳慧,权凯[2]（2019）在《SIRT1/FoxO1通路对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成的影响》一文中研究指出为研究SIRT1/FoxO1通路在奶山羊乳腺脂质合成中的作用,本实验采用0(对照)、50、100、150μmol/L的SIRT1激动剂(RES)处理奶山羊乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测脂质代谢相关基因的表达,检测细胞中甘油叁酯含量,油红O染色法观察脂滴的积累情况。结果表明:100μmol/L RES处理组的SIRT1和FoxO1基因的相对mRNA表达量高于对照组(P<0.05),乳脂关键调控因子SREBP1和PPARγ表达量下降(P<0.05);SIRT1/FoxO1通路激活后,脂肪酸合酶FASN(P<0.01)、脂肪酸去饱和酶SCD1(P<0.01)和脂肪酸转运酶CD36(P<0.05)表达量均下降;而脂解相关基因HSL和ATGL的表达上调(P<0.05)。SIRT1/FoxO1激活后,细胞中甘油叁酯含量显着降低(P<0.05),脂滴积累减少。综上可知,SIRT1/FoxO1通路负调控奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成,为改善羊奶营养价值和风味提供基础资料。(本文来源于《中国畜牧杂志》期刊2019年10期）
黄江涛[3]（2019）在《表皮生长因子受体（EGFR）对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的初步研究》一文中研究指出表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸受体家族ErbB中重要成员之一,参与细胞增殖、迁移和分化等过程。本研究以奶山羊乳腺上皮原代细胞为试验材料,过表达EGFR基因并检测对细胞增殖活性的影响;添加EGF以及EGFR信号通路相关蛋白的抑制剂,检测EGFR对细胞增殖的影响、同时检测Akt以及ERK1/2信号通路的激活情况以及细胞周期蛋白的变化。获得的主要研究成果如下:(1)通过对奶山羊乳腺上皮原代细胞中进行不同浓度的EGF(0,12.5,25,50,100 ng/ml)处理,得到适宜乳腺上皮细胞中生长的浓度,结果显示12.5~50 ng/mL EGF可以促进乳腺上皮细胞的增殖。使用不同浓度AG1478处理奶山羊乳腺上皮细胞,10μmol/L的AG1478可以显着降低细胞增殖活性。成功地将pcDNA3.1-EGFR真核表达载体转染于山羊原代乳腺上皮细胞,RT-qPCR结果显示EGFR基因的mRNA水平上调25倍以上;WB结果显示,过表达EGFR基因与EGF(50 ng/mL)共同处理后,EGFR蛋白的磷酸化水平显着增加(P<0.01)。Hoechst/PI染色结果表明,对过表达EGFR的山羊乳腺上皮细胞进行EGF处理后,细胞数量明显增加;AG1478(10μmol/L)处理使细胞数目明显减少,细胞存活能力明显降低(P<0.01)。流式细胞仪检测发现,EGF(50ng/mL)增加了S期与G_2期的细胞比例,AG1478使细胞周期阻滞在G_1期,说明EGF对细胞周期的促进作用与EGFR活化关系密切。(2)血清饥饿16 h后,EGF(50 ng/mL)刺激乳腺上皮细胞,EGFR磷酸化水平随EGF处理时间延长而显着增加,ERK1/2和AKT磷酸化明显上升。EGFR抑制剂AG1478(10μmol/L)处理乳腺上皮细胞1 h后,EGF(50 ng/mL)介导的AKT、ERK1/2的磷酸化水平都显着降低。山羊乳腺上皮细胞中添加10μmol/L AG1478或10μmol/L Gefitinib 24 h后发现,P21蛋白水平明显上升,细胞周期蛋白Cyclin E1以及周期蛋白激酶CDK2蛋白水平显着下降。EGF处理乳腺上皮细胞后周期蛋白激酶CDK2表达明显增加;与EGF组相比,500 nmol/ml MK2206及1μmol/ml U0126处理乳腺上皮细胞24 h后,CDK2表达降低,说明EGFR通过下游AKT以及ERK1/2信号蛋白可调控CDK2的表达。综上所述,本试验初步研究了EGFR信号通路在奶山羊乳腺上皮细胞中的作用。通过添加EGF以及EGFR抑制剂,证明了EGFR对奶山羊乳腺上皮细胞增殖具有促进作用,ERK1/2和AKT信号通路可显着调控CDK2激酶的表达,为明确EGFR信号通路在奶山羊乳腺发育中的作用提供了理论依据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-06-01）
侯金星,安小鹏,杜晓岩,曹斌云,沈文正[4]（2019）在《MiR-3880对奶山羊乳腺上皮细胞OGR1基因的靶向调控作用》一文中研究指出为研究miR-3880对奶山羊OGR1基因的靶向调节作用,试验选用泌乳期奶山羊乳腺上皮细胞为研究材料,采用生物信息学和双荧光素酶报告载体试验,初步确定OGR1为miR-3880的靶基因。利用RT-qPCR和Western blot方法进一步研究miR-3880对OGR1的靶向作用。结果显示,miR-3880通过与OGR1基因3ˊUTR结合调控其mRNA和蛋白的表达。本试验为研究miR-3880对乳腺上皮细胞泌乳功能的调节作用提供试验基础。(本文来源于《家畜生态学报》期刊2019年05期）
李媛[5]（2019）在《腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达》一文中研究指出卵泡刺激素(FSH)是动物体内最重要的性激素之一,主要作用于生殖细胞,在个体的发育、成熟以及生殖生理方面发挥着关键作用。市场上的FSH主要分为尿源FSH和细胞工程制备的FSH,前者的产量低、来源不均一,后者生产成本高、价格昂贵,不能满足市场需求。目前,动物乳腺制备蛋白药物具有产量高、价格低的特点,但利用大动物乳腺制备FSH的研究还未见报导,主要是因为动物体内的FSH过多会导致动物体的正常生理紊乱,最终导致动物死亡。由于FSH是通过FSHα与FSHβ亚基蛋白非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白,单独的FSHα和FSHβ亚基在动物体内都不具备生物学活性。因此本研究利用腺病毒将人FSHα与FSHβ亚基蛋白分别在山羊乳腺上皮细胞(GMEC)单独表达,然后将单独表达的FSHα和FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化得到完整的重组人卵泡刺激素(rhFSH),并利用体外活性试验验证rhFSH具备生物活性。本研究针对山羊乳腺泌乳细胞在体外表达人FSH蛋白进行了探究,为将来利用大动物乳腺制备重组人卵泡刺激素提供技术依据。试验获得如下结果:1.以pIRES-FSH-neo3载体为模板,利用PCR技术,亚克隆得到了FSHα和FSHβ亚基基因。一步克隆法将目的基因分别连接在穿梭载体pAdTrack-CMV上构建了pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体。穿梭载体经鉴定后,用PmeI酶切使其线性化,与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得了pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ重组腺病毒载体。2.将鉴定正确的重组腺病毒载体pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ用PacI酶切线性化,用异丙醇沉淀法纯化之后,利用Lipofectamine 2000转染到HEK293A细胞中包装获得第一代重组腺病毒,经扩繁后得到高浓度的重组腺病毒。LaSRT法测得Ad-FSHα和Ad-FSHβ重组腺病毒浓度滴度均为1×10~9 pfu/mL。3.用重组腺病毒Ad-FSHα和Ad-FSHβ分别感染GMEC细胞,测得重组腺病毒Ad-FSHα的感染复数(MOI)为160,重组腺病毒Ad-FSHβ的MOI值为200。裂解细胞获取蛋白,经Western Blot检测表明,利用重组腺病毒可以在GMEC细胞中有效表达FSHα和FSHβ亚基蛋白。4.将GMEC细胞表达的FSHα与FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化,利用双抗夹心ELISA法及Western Blot证明FSHα与FSHβ亚基蛋白成功在体外重组成完整的rhFSH。通过观察FSH靶向结合特异性受体(FSHR)及测定HKE-293-FSHR细胞cAMP值,表明体外重组的rhFSH和阳性对照药物Gonal-F同样具备生物活性。综上所述,本研究利用腺病毒介导人卵泡刺激素基因FSHα和FSHβ在山羊乳腺上皮细胞进行表达,产生的FSHα和FSHβ亚基蛋白,经体外重组、纯化得到rhFSH,且验证得出本研究制备的rhFSH具备生物学活性。这就为下一步利用大动物乳腺以及制备转基因动物生产重组人卵泡刺激素奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
刘营[6]（2019）在《CRISPR/Cas9介导的IFN-γ基因在山羊乳腺上皮细胞定点敲入的初步研究》一文中研究指出乳房炎是由病原微生物感染引起的乳房炎症,给奶山羊养殖业带来的损失十分严重。尽管抗生素的疗法能够有效的遏制乳房炎的发生,但是细菌的变异、抗生素的残留已经严重危害人类和动物的安全。因此,利用生物技术生产具有乳房炎抗性的动物对于动物的生产具有重要的意义。研究表明干扰素(IFN-γ)能够调控机体的免疫系统,抑制引起乳房炎的细菌的增殖。作为一种重要的抗感染的免疫分子,IFN-γ能够显著的降低不同细菌造成的感染。作为一种简单的高效的精确的基因编辑技术,CRISPR/Cas9广泛应用于动物模型的建立和医学。因此,本研究通过CRISPR/Cas9系统建立转IFN-γ基因的奶山羊乳腺上皮细胞模型,为生产转IFN-γ的抗乳房炎奶山羊提供重要的理论基础。取处于泌乳期的健康崂山奶山羊乳腺组织,采用消化法培养山羊乳腺上皮细胞。通过几次消化传代将混有的成纤维细胞进行分离。为了确定所得细胞的上皮特性,采用广谱角蛋白免疫荧光染色法对细胞进行鉴定。通过试剂盒分离人外周血淋巴细胞,Trizol法提取淋巴细胞总RNA,利用反转录试剂盒合成c DNA,RT-PCR扩增得到人IFN-γ基因。针对山羊CSN2基因设计敲入位点。在OMICTOOLS下的Cas-Designe(http://www.rgenome.net/cas-designer/)上设计sg RNA,分别输入CSN2的第二外显子和第八外显子的部分序列,从中各选择3个评分较高的sg RNA,分别连入lenti CRISPR v2载体,测序验证sg RNA序列的正确性。通过分别将测序正确的质粒转染山羊成纤维细胞,T7E1酶切鉴定不同的sg RNA对山羊基因组的打靶活性,选取打靶活性较高的一对sg RNA用于后续实验。同源重组载体是通过对质粒p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP-T2A-Puro基础上改造成的,使用酶切连接的方法构建同源重组载体。同源臂的设计:5’同源臂为山羊CSN2信号肽上游(包括信号肽部分),963bp大小;3’同源臂为第八外显子(包含sg RNA序列,sg RNA靠近上游)的部分序列,729bp大小。为了利用山羊β-酪蛋白(CSN2)启动子来启动外源IFN-γ的表达,采用重迭延伸PCR的方法将5’同源臂和IFN-γ基因无缝连接在一起。构建好的载体进行测序验证连入片段序列的正确性。通过与包装质粒共转293T细胞将目的载体包装成慢病毒,通过慢病毒感染的方式转染乳腺上皮细胞,经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞,通过PCR对克隆细胞进行鉴定。并设计跨越同源臂序列的鉴别引物鉴别其是否发生同源重组。本实验的主要研究结果如下:(1)通过消化法分离培养得到了山羊乳腺上皮细胞,并鉴定了其上皮特性。(2)成功构建了针对山羊酪蛋白位点的CRISPR/Cas9载体,经T7E1酶鉴定有打靶活性。(3)通过PCR扩增测序得到人IFN-γCDS区基因序列,并构建了转人IFN-γ基因的打靶(供体)载体p CDH-LA-IFN-cop GFP-Puro-SA,并且在山羊乳腺上皮细胞中验证了打靶载体的功能。(4)通过改造的慢病毒载体介导,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了转人IFN-γ基因的山羊乳腺上皮细胞系。(本文来源于《山东农业大学》期刊2019-03-27）
伍佰鑫,张勇,李昊帮,何芳,浣成[7]（2019）在《黄嘌呤核苷对山羊乳腺上皮细胞基因表达的影响》一文中研究指出为了研究山羊泌乳机理,促进羊奶生产发展,对8头初产山羊的每半个乳房注射黄嘌呤悬浮液(试验组),对应的另外每半个乳房不注射(对照组);分别收集羊奶,都用吖啶橙染色以辨别乳脂球,分离RNA(核糖核酸),进行RNA测序等相关试验。结果表明,给山羊乳腺注射黄嘌呤,乳腺上皮细胞的基因表达出现差异,可增加乳腺干细胞的数量(提高产奶量),同时不影响乳腺干细胞群。黄嘌呤对于抑制炎症信号通路、抗菌基因上调和细胞黏附分子具有重要作用。炎症信号的下调和抗菌基因的上调,还可能对乳腺健康产生有益的影响。(本文来源于《特种经济动植物》期刊2019年02期）
张志飞,田慧彬,骆琛,柏亦陈,罗军[8]（2018）在《利用CRISPR/CAS9技术构建山羊乳腺上皮细胞TPH1基因敲除细胞系》一文中研究指出五羟色胺(5-hydroxytryphtamine,5-HT)是机体重要的单胺类神经递质,广泛分布于动物体各组织器官并参与机体多种生理功能。色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)1是5-HT合成的限速酶,在5-HT调控机体代谢过程中起关键作用。本研究旨在利用CRISPR/CAS9技术建立稳定敲除TPH1基因的山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞系,为研究山羊乳腺中5-HT调控山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells,GMEC)钙离子代谢的分子机理提供实验材料。首先根据Gen Bank中山羊TPH1基因序列(Gen Bank No.:102184739),设计靶向TPH1基因第一外显子的单导链RNA(single guide RNA,sgRNA),用pX458和pX459分别构建重组真核表达载体pX458-sgRNA和pX459-sgRNA,将重组质粒转染山羊乳腺上皮细胞,使用嘌呤霉素(1μg/mL)进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养,用Western blot、T7E1酶切、基因组DNA测序等方法鉴定基因敲除效果。结果显示:通过CRISPR/CAS9技术成功在TPH1基因第一外显子打靶产生10 bp碱基缺失。本研究成功构建并筛选获得了TPH1基因稳定敲除的单克隆山羊乳腺上皮细胞系,为5-HT调控乳腺生理的功能研究提供了重要材料。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2018年08期）
张天颖[9]（2018）在《反10、顺12共轭亚油酸（Trans10,Cis12-CLA）对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的调控作用研究》一文中研究指出山羊奶富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸。乳中短、中链脂肪酸(C8-C14)和部分长链脂肪酸(C16)主要由乳腺上皮细胞从头合成,而长链脂肪酸(C16及以上)主要通过外源吸收获得。反10、顺12共轭亚油酸(t10c12-CLA)是反刍动物瘤胃微生物代谢的中间产物,在碳链第10位和第12位形成共轭双键的十八碳烯酸,具有降低乳脂合成的作用,可抑制山羊乳腺短、中链脂肪酸的合成,然而目前t10c12-CLA调控脂肪酸的分子机制尚不明确。通过研究t10c12-CLA调控山羊乳腺上皮细胞脂代谢分子机理,对调控羊奶中脂肪酸成分和含量,改善羊奶风味以及提高羊奶品质具有重要的理论意义和实用价值。本研究通过日粮添加t10c12-CLA饲喂泌乳期西农萨能奶山羊,构建体外乳腺上皮细胞t10c12-CLA处理模型,结合转录组测序技术,细胞功能和形态学研究,基因表达和蛋白表达水平的检测,基因转录调控机制的探索,以及细胞信号转导的研究手段,探究了t10c12-CLA对山羊乳脂代谢的影响及分子调控机制,获得如下结果:1.t10c12-CLA对奶山羊泌乳性能的影响选择30只西农萨能奶山羊经产母羊,按体重和产奶量分为3组,每组10只。分别饲喂0、8 g/d(CLA-1组)和16 g/d(CLA-2组)的脂包被的共轭亚油酸(LE-CLA),结果表明,试验组与对照组相比产奶量、乳糖和乳蛋白变化不显着(P>0.05);乳脂肪含量显着降低(P<0.05)。两个试验组中短中链脂肪酸(<C16)含量均显着下降,且CLA-1和CLA-2组差异显着(P<0.05);C16:0和C16:1含量在CLA-2组中显着下降(P<0.05),而长链脂肪酸(>C16)在各组间差异均不显着(P>0.05)。饱和脂肪酸(SFA)和不饱和脂肪酸(UFA)含量分别随着CLA饲喂浓度的增加而显着降低和升高(P<0.01)。CLA-2组C16和C18去饱和指数显着高于对照组(P<0.01)。2.t10c12-CLA对山羊乳腺上皮细胞(GMECs)生长的影响对体外培养的GMECs外源添加不同浓度的t10c12-CLA,通过细胞活力、hoechst33342染色、实时定量PCR(RT-qPCR)、western blot以及细胞划痕试验发现,100μM浓度的t10c12-CLA处理GMECs后细胞增殖未受到影响,没有发现明显的细胞凋亡,但对细胞迁移表现出抑制作用。200μM浓度的t10c12-CLA处理GMECs不超过12 h时对细胞增殖未造成影响,但超过12 h时可明显抑制细胞增殖。3.t10c12-CLA处理GMECs的转录组测序(RNA-seq)与生物信息学分析对体外培养的GMECs外源添加0、100μM和200μM浓度t10c12-CLA(分别命名为CTR、TR1和TR2组),提取细胞总RNA并进行RNA-seq分析。使用山羊基因组(Capra hircus genome,ID:10731)作为参考基因组,注释到转录本一共25153条,以RPKM>0.01作为基因表达的标准,CTR、TR1和TR2组分别有17559、17455和17982个基因表达。以校正后的P值<0.05作为差异基因的阈值,TR1 vs.CTR,TR2 vs.CTR和TR1vs.TR2分别有49、854和623个差异基因。通过对差异基因组共有的41个差异基因进行GO和KEGG显着性富集分析发现,所富集到的细胞信号通路大多数与脂代谢相关。通过RT-qPCR验证测序结果可靠,同时发现ACSL4、FDPS、HMGCS1、PLIN2、SCD1和SLC2A1基因表达水平随着t10c12-CLA处理浓度增加而发生明显变化,呈现出显着的剂量依赖效应(P<0.05)。4.t10c12-CLA影响GMECs脂代谢相关基因的表达及转录调控对体外培养的GMECs外源添加100μM浓度t10c12-CLA,通过油红O染色、细胞内脂肪酸成分测定、RT-qPCR、western blot、免疫荧光染色等技术手段研究发现,t10c12-CLA能够抑制脂肪酸从头合成和去饱和过程,而长链脂肪酸(LCFA)摄取和脂滴形成相关过程被激活,胞浆脂滴的积累增加。通过荧光素酶报告试验发现,t10c12-CLA抑制了SREBP1和SCD1基因的启动子活性;进一步发现SCD1基因启动子核心区域SRE位点活性也被t10c12-CLA抑制。5.t10c12-CLA通过AMPK和mTOR通路调控GMECs脂代谢的分子途径对体外培养的山羊乳腺上皮细胞外源添加100μM、200μM浓度t10c12-CLA研究发现,t10c12-CLA能够显着降低mTOR磷酸化水平,增加AMPK磷酸化水平。Akt/mTOR通路特异性抑制剂MK-2206和Rapamycin,以及AMPK通路抑制剂Dorsomorphin处理GMECs后,Akt/mTOR通路和AMPK通路分别受到影响;抑制剂和t10c12-CLA共同处理GMECs发现,t10c12-CLA可负调控Dorsomorphin对ACACA和SCD1基因表达的上调作用;Rapamycin和t10c12-CLA对SREBF1表达的抑制作用具有协同效应。综上所述,t10c12-CLA对奶山羊乳脂代谢具有重要的调控作用,不仅降低山羊乳脂率和短中链脂肪酸含量,而且抑制GMECs脂肪酸从头合成和去饱和化过程,并通过SREBP1调控SCD1基因的转录;同时通过影响AMPK和mTOR的激酶活性调控乳脂代谢网络。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-29）
杨振山[10]（2018）在《雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖与上皮间质转化的影响及其机制研究》一文中研究指出乳腺是哺乳动物少数可以重复经历生长、功能分化和退化的器官之一,它是一种由皮肤汗腺衍生而来的外分泌腺,主要功能是泌乳。乳腺发育的情况决定着仔畜的生长发育状况及产奶量的高低。雌激素具有促进乳腺上皮细胞增殖、腺泡形成,乳腺导管延伸,泌乳发动与维持的作用,因此研究雌激素对山羊乳腺上皮细胞增殖及其表型维持的机制的具有重要意义。G蛋白偶联受体30(G-protein coupled receptor 30,GPR30)作为近年来新发现的雌激素膜受体,被激活后可介导快速非基因组效应来调控细胞的功能。实验室前期研究结果表明:雌激素在山羊乳腺上皮细胞增殖和上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程中发挥着重要的调控作用。而雌激素是否通过GPR30信号通路参与这些过程尚需进一步研究。因此本试验以关中奶山羊为试验材料,在山羊乳腺上皮细胞分离、纯化、鉴定的基础上,研究GPR30在山羊乳腺上皮细胞的表达与定位,并采用GPR30特异性激动剂G1及抑制剂G15研究雌激素/GPR30信号通路在山羊乳腺上皮细胞增殖及其上皮表型维持中的作用机制。研究内容和研究结果为:(1)采用无血清培养体系和组织块培养法,分离、纯化得到表达角蛋白18,不表达角蛋白14的上皮样细胞;进一步利用RT-PCR技术检测该细胞β-酪蛋白基因转录情况,结果表明在无血清培养体系中该细胞能够持续转录β-酪蛋白基因,进一步说明所分离得到的上皮样细胞为山羊乳腺上皮细胞。通过免疫荧光技术检测表明,在无血清培养体系中分离、纯化得到的山羊乳腺上皮细胞表达雌激素膜受体GPR30,且主要定位于细胞膜;进一步利用RT-PCR及蛋白质印迹技术检测GPR30 mRNA转录及蛋白表达情况,证明在无血清培养体系中山羊乳腺上皮细胞持续表达雌激素膜受体GPR30。(2)应用细胞计数,BrdU掺入等技术方法,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖能力的影响。结果表明,10-1000 nM的雌激素可以促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,且呈剂量依赖效应;在含有雌激素或者雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,激活雌激素/GPR30信号通路,能够促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,而无雌激素或者含有雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路未被激活,山羊乳腺上皮细胞增殖活动受明显抑制。说明,雌激素通过GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞的增殖。(3)采用免疫荧光、实时荧光定量PCR、蛋白印迹等技术,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞EMT的影响。结果表明,在含有雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被激活,能够维持山羊乳腺上皮细胞的上皮样形态特征,维持上皮细胞特异标记E-钙黏素(E-cadherin)mRNA与E-cadherin蛋白高表达,间质细胞特异标记N-钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA及蛋白低表达,EMT关键转录因子Snail2 mRNA低表达,说明雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的添加抑制了山羊乳腺上皮细胞发生EMT。而在无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被抑制,山羊乳腺上皮细胞失去上皮样细胞形态特征,表现出间质样细胞形态特征,其上皮细胞特异标记E-cadherin mRNA及其蛋白低表达,间质细胞特异标记N-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白高表达,与上皮间质转化相关的转录因子Snail2 mRNA高表达,说明无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15时,山羊乳腺上皮细胞会发生EMT。证明,雌激素/GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞上皮表型的维持,抑制EMT发生。(4)应用蛋白印迹技术检测雌激素/GPR30信号通路下游关键分子细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK 1/2)的表达情况。结果表明,雌激素可以快速激活ERK 1/2,其磷酸化水平在15 min内迅速升高,且持续至少4 h。雌激素可通过GPR30信号通路促进ERK 1/2快速磷酸化,ERK1/2参与了雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖及上皮表型维持的过程。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
奶山羊乳腺上皮细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为研究SIRT1/FoxO1通路在奶山羊乳腺脂质合成中的作用,本实验采用0(对照)、50、100、150μmol/L的SIRT1激动剂(RES)处理奶山羊乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测脂质代谢相关基因的表达,检测细胞中甘油叁酯含量,油红O染色法观察脂滴的积累情况。结果表明:100μmol/L RES处理组的SIRT1和FoxO1基因的相对mRNA表达量高于对照组(P<0.05),乳脂关键调控因子SREBP1和PPARγ表达量下降(P<0.05);SIRT1/FoxO1通路激活后,脂肪酸合酶FASN(P<0.01)、脂肪酸去饱和酶SCD1(P<0.01)和脂肪酸转运酶CD36(P<0.05)表达量均下降;而脂解相关基因HSL和ATGL的表达上调(P<0.05)。SIRT1/FoxO1激活后,细胞中甘油叁酯含量显着降低(P<0.05),脂滴积累减少。综上可知,SIRT1/FoxO1通路负调控奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成,为改善羊奶营养价值和风味提供基础资料。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
奶山羊乳腺上皮细胞论文参考文献
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标签：山羊乳腺上皮细胞(GMECs); 脂肪酸去饱和酶2基因(FADS2); 克隆; siRNA;