鸭坦布苏病毒E蛋白糖基化在病毒增殖和致病中的作用

论文摘要

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的一种急性、接触性新发传染病。2010年,DTMUV首次在我国华东地区爆发,随后迅速蔓延至全国十几个省市的禽养殖场。该病主要引起产蛋鸭的产蛋下降甚至停止,在肉鸭中主要表现为病毒性脑炎的症状,发病率90%以上,死亡率5-30%,给我国的养鸭业带来了严重的经济损失。黄病毒E蛋白糖基化修饰可以影响到病毒的复制、跨种传播和致病性,然而目前关于DTMUV E蛋白N154糖基化修饰在病毒复制、致病及引起宿主脑炎中的作用尚不完全清楚。本研究建立了DTMUV的反向遗传系统,构建了DTMUV E蛋白N154糖基化位点的突变病毒,分析了E蛋白N154糖基化在DTMUV复制、致病性和病毒性脑炎形成中的作用,为研究DTMUV致病的分子机制和新型疫苗的开发奠定基础。主要内容如下:1.E蛋白糖基化在DTMUV复制中的作用通过TCID50实验测定DTMUV野生型病毒和E蛋白糖基化突变病毒在DEF和C6/36细胞上的生长曲线,发现在DEF和C6/36细胞中E蛋白糖基化突变病毒的滴度显著低于野生型病毒。进一步研究发现消除E蛋白糖基化减弱了DTMUV在DEF和C6/36细胞上吸附、侵入和复制的能力,降低了DTMUV在DEF和C6/36细胞中装配和释放的效率。2.E蛋白糖基化在DTMUV诱导鸭神经胶质细胞炎症反应中的作用分别将DTMUV E蛋白糖基化突变病毒和野生型病毒感染鸭神经胶质细胞,通过相对qRT-PCR荧光定量发现消除E蛋白糖基化减弱了DTMUV诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12等促炎细胞因子和IL-8、CCL5等趋化因子的表达,提示消除E蛋白糖基化减弱了DTMUV诱导鸭神经胶质细胞的炎症反应。3.E蛋白糖基化在DTMUV致病性中的作用感染试验发现消除E蛋白糖基化显著减轻了DTMUV感染鸭子的临床症状,日增重降低减缓、死亡率显著降低、病毒血症减轻、脑、脾脏、肝脏和肾脏中的病毒载量显著降低,表明E蛋白糖基化在DTMUV致病中发挥重要作用。4.E蛋白糖基化在DTMUV引起神经毒性中的作用感染试验发现消除E蛋白糖基化显著减轻了DTMUV感染后鸭子的血管袖套、卫星现象、噬神经现象、胶质细胞结节、炎性细胞浸润、脑膜增厚等病理变化,免疫组织化学观察发现消除E蛋白糖基化显著降低了脑组织中DTMUV的载量,表明E蛋白糖基化在DTMUV引起的神经毒性中发挥着重要作用。5.E蛋白糖基化在DTMUV引起鸭脑部炎症反应中的作用分别取各试验组鸭子的脑皮层,通过相对qRT-PCR荧光定量发现消除E蛋白糖基化减弱了DTMUV诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12等促炎细胞因子和IL-8和CCL5等趋化因子的表达,提示E蛋白糖基化在DTMUV引起鸭脑部炎症反应中发挥重要作用。综上所述,本研究首次揭示了E蛋白糖基化对DTMUV复制周期、致病性、神经毒性以及诱导宿主神经炎症反应的影响。对于我们更深入地理解DTMUV的致病机理具有重要意义,也将为抗DTMUV的疫苗设计及药物筛选提供新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 1 文献综述
•   1.1 鸭坦布苏病毒（DTMUV）简介
•     1.1.1 DTMUV的危害
•     1.1.2 DTMUV的分子生物学特征
•       1.1.2.1 DTMUV的病毒形态
•       1.1.2.2 DTMUV的基因组特征
•     1.1.3 黄病毒E蛋白简介
•     1.1.4 黄病毒的复制周期
•     1.1.5 黄病毒引起的病毒性脑炎及神经炎症
•   1.2 DTMUV E蛋白糖基化
•     1.2.1 DTMUV E蛋白糖基化简介
•     1.2.2 黄病毒E蛋白糖基化对病毒复制的影响
•     1.2.3 E蛋白糖基化对黄病毒致病性的影响
•     1.2.4 E蛋白糖基化对病毒诱导神经炎症的影响
• 2 目的与意义
• 3 材料与方法
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 菌株、毒株和细胞
•     3.1.2 构建质粒所需材料
•     3.1.3 工具酶及主要试剂
•     3.1.4 抗体及间接免疫荧光实验试剂及缓冲液
•     3.1.5 培养基及相关试剂配制
•     3.1.6 主要缓冲液和试剂及其配制
•     3.1.7 实验动物
•     3.1.8 主要实验仪器及设备
•     3.1.9 分子生物学分析软件
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 构建DTMUV-MC株全长cDNA感染性克隆
•       3.2.1.1 病毒RNA提取
•       3.2.1.2 反转录
•       3.2.1.3 PCR扩增DTMUV-MC株全长c DNA的四个片段
•       3.2.1.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测
•       3.2.1.5 PCR或酶切产物的回收与纯化
•       3.2.1.6 外源DNA片段与平末端质粒载体的连接反应
•       3.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
•       3.2.1.8 连接产物的转化
•       3.2.1.9 重组质粒的制备与鉴定
•       3.2.1.10 质粒的双酶切
•       3.2.1.11 目的片段的体外连接
•       3.2.1.12 体外转录和病毒拯救
•     3.2.2 DTMUV MC株 E蛋白糖基化突变病毒的拯救
•       3.2.2.1 突变DTMUV MC株 E蛋白糖基化位点
•     3.2.3 DTMUV间接免疫荧光（IFA）鉴定
•     3.2.4 DTMUV病毒噬斑实验
•     3.2.5 半数细胞培养物感染量（TCID50）的测定
•     3.2.6 鸭神经胶质细胞制备
•     3.2.7 Western Blot样品制备
•     3.2.8 N位糖基化的鉴定
•       3.2.8.1 DTMUV糖基化修饰分析
•       3.2.8.2 Endo Hf和 PNGase F酶解实验
•     3.2.9 DTMUVs致病性试验
•       3.2.9.1 致病性试验设计
•       3.2.9.2 DTMUV荧光定量qRT-PCR
•       3.2.9.3 病理切片与免疫组化切片制备
•     3.2.9.3.1 病理切片制备
•     3.2.9.3.2 免疫组化切片染色
•     3.2.10 统计学方法
• 4 结果与分析
•   4.1 DTMUV MC株感染性克隆的构建
•   4.2 DTMUV MC株 E蛋白糖基化位点突变株的构建
•   4.3 DTMUV野生型和E蛋白糖基化突变病毒IFA及病毒噬斑
•   4.4 N154Q、N154I突变消除了DTMUV E蛋白154 位糖基化
•   4.5 消除E糖基化减弱DTMUV在 DEF和 C6/36 细胞中的复制
•   4.6 E蛋白糖基化突变影响DTMUV在 DEF中的复制周期
•     4.6.1 E蛋白糖基化突变减弱DTMUV在 DEF中的吸附和侵入
•     4.6.2 E蛋白糖基化突变减弱DTMUV在 DEF内的装配、释放
•   4.7 E蛋白糖基化突变影响DTMUV在 C6/36 中的复制周期
•     4.7.1 E蛋白糖基化突变减弱DTMUV在 C6/36 中的吸附和侵入
•     4.7.2 E蛋白糖基化突变减弱DTMUV在 C6/36 内的装配、释放
•   4.8 E蛋白糖基化突变减弱DTMUV诱导鸭胶质细胞的炎症反应
•   4.9 E蛋白糖基化突变减弱了DTMUV的致病性
•     4.9.1 鸭子感染DTMUV后的临床症状、增重和存活率情况
•     4.9.2 鸭子感染DTMUV后剖检组织病理学变化
•     4.9.3 鸭子感染DTMUV后大脑免疫组织化学分析
•     4.9.4 E蛋白糖基化突变影响DTMUV在鸭子体内的增殖
•     4.9.5 消除E蛋白糖基化减轻了DTMUV诱导鸭子的神经炎症
• 5 讨论与结论
•   5.1 讨论
•     5.1.1 构建DTMUV感染性克隆及E蛋白糖基化突变病毒的拯救
•     5.1.2 E蛋白糖基化对DTMUV复制周期的影响
•     5.1.3 E蛋白糖基化对DTMUV在鸭子体内增殖和致病的影响
•     5.1.4 E蛋白糖基化对DTMUV引起的炎症反应的影响
•   5.2 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘德建

导师: 罗锐

关键词: 鸭坦布苏病毒,蛋白,糖基化,增殖,致病性,神经毒性,神经炎症

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000414

总页数: 71

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