导读:本文包含了端结构域论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:噬菌体phi29,gp16蛋白,C端结构域,X射线小角散射
端结构域论文文献综述
武飞飞,蔡汝洁,陈婷,张云龙,陆昌瑞[1]（2019）在《噬菌体phi29末端酶gp16蛋白C端结构域在溶液中的构象分析》一文中研究指出噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有叁个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预测中发现gp16蛋白的C端结构域可能与pRNA或DNA结合,但尚未有相关文献可以证明这种相互作用,因此其结构的解析成为研究其功能的关键.本文利用大肠杆菌SUMO表达系统,对噬菌体phi29 gp16蛋白的C端结构域进行重组构建并诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析纯化,再用分子排阻色谱获得高纯度的目的蛋白质单体,纯度达到95%左右.最后用X射线小角散射技术(small angle X-ray scattering)对其构象进行分析,收集小角散射数据,当目的蛋白的浓度为1.3 g/L、所得到的目的蛋白的叁维结构与同源蛋白FtsK的晶体结构高度拟合,且通过CRYSOL软件反推计算的曲线与实验曲线高度重合.通过原核表达、纯化及结构分析,成功获得了该结构域在溶液中的状态信息.这一研究不仅为后续关于该结构域的功能研究奠定基础,也为病毒感染的诊断和治疗提供新思路.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2019年03期）
杨笃晓[2]（2018）在《Slingshot N端结构域自抑制机制及其被F-actin激活机制的研究》一文中研究指出丝切蛋白磷酸酶Slingshot属于I型酪氨酸磷酸酶家族(Protein Tyrosine Phophotase,PTP)中的双特异性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,DUSP)家族,双特异性磷酸酶家族不同与经典型的蛋白酪氨酸磷酸酶家族,它们既能够去磷酸化酪氨酸(pY),又能够去磷酸化丝/苏氨酸(pS/T)。目前被报道已知的Slingshot特异性底物是磷酸化的丝切蛋白(p-Cofilin);Slingshot可以通过调节底物Cofilin的去磷酸化来影响肌动蛋白(F-actin)的聚合与解离,从而参与细胞骨架动力学;另一方面,F-actin会与Slingshot磷酸酶上的某些特定氨基酸或是结构域相结合,从而极大提高Slingshot磷酸酶的活力。最近的研究发现,在一些癌症,阿尔兹海默病及某些血管性疾病中都检测到了 Slingshot磷酸酶的活性异常升高;尽管Slingshot2(SSH2)催化结构域晶体结构在2006时年就被解析出,但目前关于SSH2磷酸酶更为全面深入的底物催化机制及如何被F-actin激活的相关机制并没有详细的说明。一、研究目的:1.Slingshot磷酸酶动力学催化机制研究;2.Slingshot底物选择性机制的研究;3.F-actin激活Slingshot机制研究;4.如何通过我们自己建立的方法高效筛选Slingshot的小分子抑制剂或激动剂;二、研究方法:主要研究方法简述如下:1.通过PCR方法构建一系列Slingshot截短质粒,利用大肠杆菌BL21感受态细胞体外表达Slingshot截短蛋白,用于后期酶活检测;2.选用结构不同的小分子底物及生理底物或是磷酸化短肽检测Slingshot对底物的选择性机制;3.绘制pH依赖性曲线,检测Slingshot磷酸酶的酸碱催化机制;4.绘制底物解离基团依赖性曲线,检测Slingshot对产物小分子解离基团的依赖性大小;5.利用肌肉丙酮粉制备F-actin,以pNPP和p-Cofilin作为底物检测F-actin激活Slingshot机制;6.绘制底物解离基团依赖性曲线,进一步明确F-actin激活Slingshot机制;7.体外Trypsin酶切实验验证F-actin激活Slingshot属于变构激活调节;8.在Slingshot蛋白N端特定位点引入半胱氨酸突变和小分子荧光底物mBBr标记方法,通过连续荧光光谱扫描检测F-actin激活Slingshot分子机制;9.FlAsH-BRET实验用来检测验MCF-7细胞给予NRG刺激时,细胞内Slingshot激活机制;10.利用FlAsH-BRET方法,拓展Slingshot酶活检测探针,可以用来检测不同生理条件下的Slingshot酶活或是筛选小分子抑制剂、激动剂;叁、结果:1.SSH2 N端结构域具有自抑制作用通过对已构建好的一些列SSH2不同长度截短蛋白的表达纯化,最后酶活检测发现随着SSH2 N端(1-305)的不断截短,SSH2酶活逐渐增强,相反,N端结构域的存在会抑制SSH2酶活,对生理底物p-Cofilin蛋白的活性检测,同样发现SSH2 N端对生理底物有抑制作用,细胞内检测SSH2全长蛋白和截去N端1-227的截短蛋白酶活相比,同样发现SSH2的N端对酶活有自抑制的作用。对pNPP(单环),DiFMUP(双环),OMFP(多环)小分子底物酶活检测发现,SSH2对于多环底物相对于单环底物选择性较好;SSH2 N端233-305结构域对于生理底物的识别起着关键作用,没有233-305区域,SSH2不能识别Cofilin无法去磷酸底物。2.SSH2 N端结构域自抑制属于非竞争抑制方式将SSH2 N端1-227结构域在体外表达纯化,与SSH2 233-490和SSH2305-490两个磷酸酶共孵育,检测加入1-227后的233-490和305-490对小分子底物pNPP酶活,发现随着1-227蛋白的浓度不断增加,233-490和305-490对pNPP的亲和力Km值并无变化,而Vmax降低,属于非竞争抑制方式;由于233-305对于生理底物cofilin的识别是必须的,所以检测1-227对SSH2 233-490的Ki抑制常数,同样发现SSH2 N端的抑制是非竞争的方式,即SSH2 N端并不与底物竞争性的结合SSH2活性中心,应该是作用于活性中心外的某些关键氨基酸或是结构域。3.SSH2磷酸酶催化机制属于酸碱催化,并且N端结构域限制了通用酸对产物小分子解离基团的稳定性绘制pH依赖性曲线检测到SSH2 1-490,233-490,305-490的基本催化机理同大部分经典磷酸酶催化机理相似,都属于酸碱催化,通过通用酸和通用碱的作用调节催化;此外,pH profile中,当pH>6之后,1-490的pH曲线要明显比233-490和305-490 pH曲线浅,说明通用酸在1-490催化过程中的作用明显弱于在233-490和305-490中的作用,可能是N端结构域的存在限制了通用酸对小分子解离基团的稳定性作用。绘制Leaving group dependence曲线,发现SSH2 1-490的β1绝对值明显大于其它233-490和305-490两个蛋白,也就是说1-490在N端存在的情况下,通用酸对产物解离基团的稳定性弱于其它两个蛋白。4.F-actin通过解除N端自抑制激活SSH2酶活,增加产物解离基团稳定性将F-actin分别与 SSH2 1-490,SSH2 233-490,SSH2 305-490共孵育,检测SSH2不同截短对生理底物的酶活;结果发现加入F-actin后1-490酶活显着提高,而233-490和305-490酶活基本无变化,说明F-actin可以解除SSH2 N端1-233对酶活的抑制作用;换用pNPP小分子底物检测,同样发现加入F-actin后,1-490和1-455的酶活显着升高,而其它截短蛋白活性并无明显变化。为了验证F-actin的激活机制,我们检测加入F-actin后,SSH2对不同pKa值的小分子底物的解离基团依赖性,结果表明加入F-actin后,1-490的直线斜率变小,接近233-490的β1值,说明F-actin加入之后,通用酸开始发挥作用,底物解离基团稳定性增加,N端对通用酸的限制作用被解除,SSH2酶活升高。5.F-actin激活SSH2属于别构激活体外Trypsin酶切实验证实,加入F-actin后,SSH2 1-490酶切的蛋白片段大小与不加F-actin时蛋白酶切片段大小不同;1-490单独酶切时,酶切后片段大小在40kDa和28kDa,加入F-actin之后,酶切后片段变为44kDa。通过Adman N端降解测序法和SSH2 1-490 一级结构氨基酸序列分析,1-490单独存在时,酶切位点在R66,K291和K450;加入F-actin后,原本暴露在结构表面的K291被F-actin保护起来,免于Trypsin的酶切;而位于第2个a螺旋和第3个β折叠之间loop上的R332在没有F-actin时掩藏在里面,加入F-actin后暴露在结构表面,被Trypine识别并酶切。6.F-actin激活SSH2的分子机制在SSH2 N端特定位点(19,63,78,98,146,161)引入半胱氨酸突变,用小分子荧光底物mBBr标记上述突变的半胱氨酸,同时在此基础上将VYD-loop中的Tyr突变成Trp,通过荧光光谱连续扫面检测N端哪些氨基酸参与了SSH2的构象变化,及N端的哪个位置氨基酸与VYD-loop发生了相互作用。荧光淬灭实验证实了,当SSH2处于静息状态时,C19和C146距离VYD loop较远,而C63,C78,C98,C161 距离VYD-loop较近,当 F-actin激活 SSH2后,C63开始远离VYD-loop,C19则开始靠近VYD-loop。7.细胞内SSH2被F-actin激活的分子机制利用FlAsH-BRET实验验证我们在体外提出的F-actin激活SSH2的机制同样适用于生理条件下的激活机制,将真核表达载体SSH2全长质粒N端23位,63位插入rLuc(海肾荧光素酶),VYD-loop中插入6个氨基酸的特定位点序列CCPGCC,根据NRG刺激前后,BRET信号强度变化判断出L63在细胞刺激后远离VYD-loop,而23位氨基酸在细胞刺激后BRET信号强度增加,说明23位氨基酸在细胞受刺激后向VYD-loop靠近。8.将SSH2-63-FlAsH拓展成可以检测SSH2酶活的分子探针FlAsH-BRET实验中,通过计算我们发现△BRET值的大小与p-Cofilin去磷酸化程度之间成正相关性,即当△BRET值增大时,SSH2磷酸酶活力增加。根据之前的文献报道,当SSH2 N端21,25,32,36位的丝氨酸被GSK激酶磷酸化之后,SSH2的磷酸酶活力降低;我们在SSH2-63-FlAsH质粒的基础之上,将N端21,25,32,36分别突变成酸性氨基酸Asp和Glu,来模仿磷酸化状态,构建成了新的SSH2-DDEE-63-FlAsH质粒。将上述质粒在细胞中过表达之后,检测ABRET信号,发现ABRET信号强度减弱,突变后SSH2的磷酸酶活力降低,可能与N端氨基酸突变之后,无法使N端结构域从VYD loop解离有关。四、结论:1.SSH2 N端结构域具有酶活自抑制作用,这种抑制方式表现为非竞争抑制。2.SSH2催化机理属于酸碱催化,N端结构域作用于VYD-loop中的通用酸D361,限制其活性,降低通用酸对产物解离基团的稳定性。3.F-actin可以激活SSH2酶活,其激活机制是解除了N端结构域对通用酸D361的限制作用,提高产物解离基团的稳定性。4.F-actin激活SSH2的同时,SSH2构型发生变化,属于变构激活机制。5.荧光淬灭实验,连续荧光光谱检测发现了SSH2 N端参与酶活调节机制中的关键氨基酸分子,63C在SSH2静息时靠近VYD-loop,激活时远离VYD-loop;19C在SSH2静息状态时,远离VYD-loop,激活状态时靠近VYD-loop。6.体外证实的F-actin激活SSH2分子机制同时适用于生理状态下SSH2激活机制。7.拓展了新的FlAsH-BRET探针,用于筛选检测SSH2不同状况下的磷酸酶活力大小,及筛选SSH2小分子抑制剂/激动剂。五、意义:我们的研究发现了SSH2 N端结构域的自抑制作用并阐明了自抑制机制及F-actin激活SSH2的变构调节机制,对于理解Slingshot功能异常导致的各种临床疾病提供理论基础,对于今后相关疾病的预防治疗有重要意义。我们的研究结果不仅揭示了人类Slingshot磷酸酶的自抑制机制和变构激活机制,为将来研究Slingshot信号通路及生理过程提供重要理论基础,有重要意义外,还拓展了新的FlAsH-BRET探针,有助于检测不同生理病理状况下的Slingshot磷酸酶活力大小。(本文来源于《山东大学》期刊2018-11-11）
陈小焱,姚宏伟,毕放开,郭晨云,林东海[3]（2018）在《鸟胞内分枝杆菌Lon蛋白酶N端结构域的溶液结构和功能研究》一文中研究指出Lon蛋白酶在真核和原核生物中都发挥着重要作用,可以通过选择性降解受损和错误折迭的蛋白,以防这些蛋白形成有毒聚集体从而控制蛋白质量维持细胞内稳态[1]。迄今为止Lon蛋白酶催化作用的分子机制还不清楚,特别是Lon蛋白酶的N端结构域是如何特异性识别并结合底物仍属未知。(本文来源于《2018第二十届全国波谱学学术年会会议论文摘要集》期刊2018-10-12）
曾艳,郑宏臣,付晓平,徐健勇,宋诙[4]（2018）在《普鲁兰酶N端结构域CBM68对酶学性质的影响》一文中研究指出碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11的催化结构域替换成Pul A的催化结构域,得到重组酶Pul-12.结果显示,重组酶Pul-11和Pul-12的最适温度均较Pul B提高了10℃,最适pH分别提高了0.5和1;60℃下热稳定性分别提高了41.4%和44.0%;同时,重组酶Pul-11和Pul-12的底物亲和力和催化效率较Pul B也均有一定程度提高.可见,来源于耐热普鲁兰酶的新型底物结构域CBM68对普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用pH及催化效率具有重要影响.(本文来源于《南开大学学报(自然科学版)》期刊2018年04期）
朱文俊,毛雪玲,邱晓挺[5]（2018）在《酵母RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域激酶CTDK-Ⅰ及其亚基的结构与功能》一文中研究指出RNA聚合酶Ⅱ最大亚基Rpb1的羧基端结构域(carboxyl-terminal repeat domain,CTD)是RNA聚合酶Ⅱ发挥转录延伸功能所必需的,对其执行精确的转录调节功能至关重要。酵母细胞周期蛋白依赖性激酶CTDK-Ⅰ (carboxyl-terminal repeat domain kinase,CTDK-Ⅰ)由CTK1、CTK2和CTK3组成,作用于RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域,动态磷酸化CTD的七肽重复序列(YSPTSPS)来调控转录和翻译。酵母中的特异性蛋白CTK3与特殊的细胞周期蛋白CTK2结合形成异二聚体,再与CTDK-Ⅰ的催化亚基CTK1结合以调节其活性。CTK1作为细胞周期蛋白CDK (cyclin dependent kinase,CDK)的同源蛋白,其结构与功能的研究可拓展人们对CDK蛋白家族的认识;CTK2-CTK3复合物对CTK1调控机制的研究也可为细胞周期蛋白抑制剂的研发提供新的思路。本文简述了酵母CTDK-Ⅰ的功能特点及其亚基的结构与功能以及亚基间的相互作用,并展望了CTDK-Ⅰ复合物的研究前景。(本文来源于《微生物学报》期刊2018年10期）
罗砚曦,蒋依俐,阎辉[6]（2017）在《利用冰核蛋白N-端结构域在大肠杆菌表面展示人存活蛋白》一文中研究指出存活蛋白(survivin)是高度特异的广谱肿瘤相关抗原,利用冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)表面展示系统研究在大肠杆菌细胞表面展示人存活蛋白的可行性。将人存活蛋白基因片段和报告基因Cherry融合到冰核蛋白N-端,构建表面展示载体p ET-INP-CHY-SUV并转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导后可检测到红荧光,荧光强度在胰蛋白酶的作用下降低,完整细胞ELISA实验及免疫荧光实验可检测和观察到绿荧光,表明人存活蛋白在重组菌中得到表达,并且成功展示于细胞表面,为进一步研制新型的肿瘤DNA疫苗奠定基础。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2017年12期）
李雪,陈格飞,张晓玲,孟清[7]（2017）在《大腹园蛛鞭状腺蛛丝蛋白N端结构域的克隆表达及圆二色谱分析》一文中研究指出鞭状腺蛛丝是6种蛛丝中延展性最好的丝,由鞭状腺蛛丝蛋白(FlSp)构成,具有极大的潜在应用价值。目前,有关FlSp的末端功能模块(NT和CT)编码基因的报道极少,且其结构和功能均尚未明确,这在一定程度上限制了鞭状腺蛛丝的仿生。现利用5′-RACE的方法,以大腹园蛛总RNA和基因组DNA为模板,首次获取了大腹园蛛FlSp NT模块(FlSp_A.v-NT)的完整编码基因,并对其成功进行了克隆、表达及纯化,产量可达60 mg/L;同时,利用圆二色谱(circular dichroism,CD)对FlSp_A.v-NT的二级结构进行了分析,结果显示其主要以α螺旋构象存在,这是首次对FlSp NT的二级结构进行探索,为后续FlSp NT结构功能的研究提供了材料,奠定了研究基础。(本文来源于《生命科学研究》期刊2017年05期）
潘婷,邱全胜[8]（2017）在《N-端结构域决定拟南芥KEA1和KEA2的亚细胞定位及定位与功能的关系》一文中研究指出采用转基因技术,分析了AtKEA1和AtKEA2N-端结构域的生物功能。亚细胞定位分析显示,完整的AtKEA1和AtKEA2定位于叶绿体,只含有AtKEA1和AtKEA2的N-端100个氨基酸的多肽片段也分布在叶绿体;然而,缺失N-端结构域的AtsKEA1和AtsKEA2则分布在细胞质中。转基因植株生长表型分析发现,完整的AtKEA1和AtKEA2能很好地恢复kea1kea2双突变体叶片发黄、生长受阻的表型。而缺失N-端结构域的AtsKEA1和AtsKEA2却不能恢复kea1 kea2双突变体的表型。研究结果表明,N-端结构域决定AtKEA1和AtKEA2的亚细胞定位;并且正确的亚细胞定位对于AtKEA1和AtKEA2参与调节植物生长发育的生物功能至关重要。(本文来源于《中国科技论文》期刊2017年18期）
薛斌[9]（2017）在《Smad 7 N端结构域的生物信息学与生物化学特性分析》一文中研究指出从基础性生理特征角度展开分析,人体内部Smad 7 N端结构域与人体转化生长因子-β的基础生理功能的发生发展演化路径之间,本身具备表现程度显着且鲜明的相互制约关系结构,本文围绕Smad 7 N端结构域的生物信息学与生物化学特性,择取两个具体方面展开了简要的分析论述。(本文来源于《生物化工》期刊2017年04期）
张尚荣,赵青,李树杰[10]（2017）在《二苯基氯化碘盐与电压门控质子通道Hv1的C-端结构域的相互作用（英文）》一文中研究指出电压门控质子通道(Hv1)在"呼吸爆发"过程中参与细胞内p H的调节,以补偿NADPH氧化酶产生电子时的电荷.Hv1胞内C端结构域通过α螺旋二级结构形成二聚体,这种结构对蛋白质定位和在吞噬体中可能感应氧化还原反应起重要作用.二苯基氯化碘盐(DPI)经常被用来抑制细胞内活性氧的产生.通过荧光光谱实验研究了DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用.静态荧光猝灭的存在表明DPI与Hv1的C端结构域之间有相互作用.此外,锌离子的存在使DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用增强,表明锌离子影响DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用.研究结果表明,DPI与Hv1的C端结构域之间有相互作用,这可能为DPI抑制细胞内活性氧的产生机理提供新的解释.(本文来源于《南开大学学报(自然科学版)》期刊2017年04期）
端结构域论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
丝切蛋白磷酸酶Slingshot属于I型酪氨酸磷酸酶家族(Protein Tyrosine Phophotase,PTP)中的双特异性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,DUSP)家族,双特异性磷酸酶家族不同与经典型的蛋白酪氨酸磷酸酶家族,它们既能够去磷酸化酪氨酸(pY),又能够去磷酸化丝/苏氨酸(pS/T)。目前被报道已知的Slingshot特异性底物是磷酸化的丝切蛋白(p-Cofilin);Slingshot可以通过调节底物Cofilin的去磷酸化来影响肌动蛋白(F-actin)的聚合与解离,从而参与细胞骨架动力学;另一方面,F-actin会与Slingshot磷酸酶上的某些特定氨基酸或是结构域相结合,从而极大提高Slingshot磷酸酶的活力。最近的研究发现,在一些癌症,阿尔兹海默病及某些血管性疾病中都检测到了 Slingshot磷酸酶的活性异常升高;尽管Slingshot2(SSH2)催化结构域晶体结构在2006时年就被解析出,但目前关于SSH2磷酸酶更为全面深入的底物催化机制及如何被F-actin激活的相关机制并没有详细的说明。一、研究目的:1.Slingshot磷酸酶动力学催化机制研究;2.Slingshot底物选择性机制的研究;3.F-actin激活Slingshot机制研究;4.如何通过我们自己建立的方法高效筛选Slingshot的小分子抑制剂或激动剂;二、研究方法:主要研究方法简述如下:1.通过PCR方法构建一系列Slingshot截短质粒,利用大肠杆菌BL21感受态细胞体外表达Slingshot截短蛋白,用于后期酶活检测;2.选用结构不同的小分子底物及生理底物或是磷酸化短肽检测Slingshot对底物的选择性机制;3.绘制pH依赖性曲线,检测Slingshot磷酸酶的酸碱催化机制;4.绘制底物解离基团依赖性曲线,检测Slingshot对产物小分子解离基团的依赖性大小;5.利用肌肉丙酮粉制备F-actin,以pNPP和p-Cofilin作为底物检测F-actin激活Slingshot机制;6.绘制底物解离基团依赖性曲线,进一步明确F-actin激活Slingshot机制;7.体外Trypsin酶切实验验证F-actin激活Slingshot属于变构激活调节;8.在Slingshot蛋白N端特定位点引入半胱氨酸突变和小分子荧光底物mBBr标记方法,通过连续荧光光谱扫描检测F-actin激活Slingshot分子机制;9.FlAsH-BRET实验用来检测验MCF-7细胞给予NRG刺激时,细胞内Slingshot激活机制;10.利用FlAsH-BRET方法,拓展Slingshot酶活检测探针,可以用来检测不同生理条件下的Slingshot酶活或是筛选小分子抑制剂、激动剂;叁、结果:1.SSH2 N端结构域具有自抑制作用通过对已构建好的一些列SSH2不同长度截短蛋白的表达纯化,最后酶活检测发现随着SSH2 N端(1-305)的不断截短,SSH2酶活逐渐增强,相反,N端结构域的存在会抑制SSH2酶活,对生理底物p-Cofilin蛋白的活性检测,同样发现SSH2 N端对生理底物有抑制作用,细胞内检测SSH2全长蛋白和截去N端1-227的截短蛋白酶活相比,同样发现SSH2的N端对酶活有自抑制的作用。对pNPP(单环),DiFMUP(双环),OMFP(多环)小分子底物酶活检测发现,SSH2对于多环底物相对于单环底物选择性较好;SSH2 N端233-305结构域对于生理底物的识别起着关键作用,没有233-305区域,SSH2不能识别Cofilin无法去磷酸底物。2.SSH2 N端结构域自抑制属于非竞争抑制方式将SSH2 N端1-227结构域在体外表达纯化,与SSH2 233-490和SSH2305-490两个磷酸酶共孵育,检测加入1-227后的233-490和305-490对小分子底物pNPP酶活,发现随着1-227蛋白的浓度不断增加,233-490和305-490对pNPP的亲和力Km值并无变化,而Vmax降低,属于非竞争抑制方式;由于233-305对于生理底物cofilin的识别是必须的,所以检测1-227对SSH2 233-490的Ki抑制常数,同样发现SSH2 N端的抑制是非竞争的方式,即SSH2 N端并不与底物竞争性的结合SSH2活性中心,应该是作用于活性中心外的某些关键氨基酸或是结构域。3.SSH2磷酸酶催化机制属于酸碱催化,并且N端结构域限制了通用酸对产物小分子解离基团的稳定性绘制pH依赖性曲线检测到SSH2 1-490,233-490,305-490的基本催化机理同大部分经典磷酸酶催化机理相似,都属于酸碱催化,通过通用酸和通用碱的作用调节催化;此外,pH profile中,当pH>6之后,1-490的pH曲线要明显比233-490和305-490 pH曲线浅,说明通用酸在1-490催化过程中的作用明显弱于在233-490和305-490中的作用,可能是N端结构域的存在限制了通用酸对小分子解离基团的稳定性作用。绘制Leaving group dependence曲线,发现SSH2 1-490的β1绝对值明显大于其它233-490和305-490两个蛋白,也就是说1-490在N端存在的情况下,通用酸对产物解离基团的稳定性弱于其它两个蛋白。4.F-actin通过解除N端自抑制激活SSH2酶活,增加产物解离基团稳定性将F-actin分别与 SSH2 1-490,SSH2 233-490,SSH2 305-490共孵育,检测SSH2不同截短对生理底物的酶活;结果发现加入F-actin后1-490酶活显着提高,而233-490和305-490酶活基本无变化,说明F-actin可以解除SSH2 N端1-233对酶活的抑制作用;换用pNPP小分子底物检测,同样发现加入F-actin后,1-490和1-455的酶活显着升高,而其它截短蛋白活性并无明显变化。为了验证F-actin的激活机制,我们检测加入F-actin后,SSH2对不同pKa值的小分子底物的解离基团依赖性,结果表明加入F-actin后,1-490的直线斜率变小,接近233-490的β1值,说明F-actin加入之后,通用酸开始发挥作用,底物解离基团稳定性增加,N端对通用酸的限制作用被解除,SSH2酶活升高。5.F-actin激活SSH2属于别构激活体外Trypsin酶切实验证实,加入F-actin后,SSH2 1-490酶切的蛋白片段大小与不加F-actin时蛋白酶切片段大小不同;1-490单独酶切时,酶切后片段大小在40kDa和28kDa,加入F-actin之后,酶切后片段变为44kDa。通过Adman N端降解测序法和SSH2 1-490 一级结构氨基酸序列分析,1-490单独存在时,酶切位点在R66,K291和K450;加入F-actin后,原本暴露在结构表面的K291被F-actin保护起来,免于Trypsin的酶切;而位于第2个a螺旋和第3个β折叠之间loop上的R332在没有F-actin时掩藏在里面,加入F-actin后暴露在结构表面,被Trypine识别并酶切。6.F-actin激活SSH2的分子机制在SSH2 N端特定位点(19,63,78,98,146,161)引入半胱氨酸突变,用小分子荧光底物mBBr标记上述突变的半胱氨酸,同时在此基础上将VYD-loop中的Tyr突变成Trp,通过荧光光谱连续扫面检测N端哪些氨基酸参与了SSH2的构象变化,及N端的哪个位置氨基酸与VYD-loop发生了相互作用。荧光淬灭实验证实了,当SSH2处于静息状态时,C19和C146距离VYD loop较远,而C63,C78,C98,C161 距离VYD-loop较近,当 F-actin激活 SSH2后,C63开始远离VYD-loop,C19则开始靠近VYD-loop。7.细胞内SSH2被F-actin激活的分子机制利用FlAsH-BRET实验验证我们在体外提出的F-actin激活SSH2的机制同样适用于生理条件下的激活机制,将真核表达载体SSH2全长质粒N端23位,63位插入rLuc(海肾荧光素酶),VYD-loop中插入6个氨基酸的特定位点序列CCPGCC,根据NRG刺激前后,BRET信号强度变化判断出L63在细胞刺激后远离VYD-loop,而23位氨基酸在细胞刺激后BRET信号强度增加,说明23位氨基酸在细胞受刺激后向VYD-loop靠近。8.将SSH2-63-FlAsH拓展成可以检测SSH2酶活的分子探针FlAsH-BRET实验中,通过计算我们发现△BRET值的大小与p-Cofilin去磷酸化程度之间成正相关性,即当△BRET值增大时,SSH2磷酸酶活力增加。根据之前的文献报道,当SSH2 N端21,25,32,36位的丝氨酸被GSK激酶磷酸化之后,SSH2的磷酸酶活力降低;我们在SSH2-63-FlAsH质粒的基础之上,将N端21,25,32,36分别突变成酸性氨基酸Asp和Glu,来模仿磷酸化状态,构建成了新的SSH2-DDEE-63-FlAsH质粒。将上述质粒在细胞中过表达之后,检测ABRET信号,发现ABRET信号强度减弱,突变后SSH2的磷酸酶活力降低,可能与N端氨基酸突变之后,无法使N端结构域从VYD loop解离有关。四、结论:1.SSH2 N端结构域具有酶活自抑制作用,这种抑制方式表现为非竞争抑制。2.SSH2催化机理属于酸碱催化,N端结构域作用于VYD-loop中的通用酸D361,限制其活性,降低通用酸对产物解离基团的稳定性。3.F-actin可以激活SSH2酶活,其激活机制是解除了N端结构域对通用酸D361的限制作用,提高产物解离基团的稳定性。4.F-actin激活SSH2的同时,SSH2构型发生变化,属于变构激活机制。5.荧光淬灭实验,连续荧光光谱检测发现了SSH2 N端参与酶活调节机制中的关键氨基酸分子,63C在SSH2静息时靠近VYD-loop,激活时远离VYD-loop;19C在SSH2静息状态时,远离VYD-loop,激活状态时靠近VYD-loop。6.体外证实的F-actin激活SSH2分子机制同时适用于生理状态下SSH2激活机制。7.拓展了新的FlAsH-BRET探针,用于筛选检测SSH2不同状况下的磷酸酶活力大小,及筛选SSH2小分子抑制剂/激动剂。五、意义:我们的研究发现了SSH2 N端结构域的自抑制作用并阐明了自抑制机制及F-actin激活SSH2的变构调节机制,对于理解Slingshot功能异常导致的各种临床疾病提供理论基础,对于今后相关疾病的预防治疗有重要意义。我们的研究结果不仅揭示了人类Slingshot磷酸酶的自抑制机制和变构激活机制,为将来研究Slingshot信号通路及生理过程提供重要理论基础,有重要意义外,还拓展了新的FlAsH-BRET探针,有助于检测不同生理病理状况下的Slingshot磷酸酶活力大小。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
端结构域论文参考文献
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