导读:本文包含了肝素寡糖论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:肝素,化学,硫酸,供体,细胞,腺苷,糖苷。
肝素寡糖论文文献综述
张成盈[1]（2019）在《基于化学酶法合成的肝素寡糖探究肝素酶Ⅰ的催化切割模式》一文中研究指出肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)残基与氨基葡萄糖(GlcN)残基以1→4糖苷键连接而成的二糖重复单元组成的糖胺聚糖,因糖链长短不一、各糖单元存在可变的硫酸化、异构化等修饰,使其成为分子量、精细结构不均一的多组分混合物,并表现出多种多样的生物活性。作为有机合成中最具挑战性的研究领域之一,国内外多个研究小组已成功发展了许多肝素/HS寡糖合成的新方法和策略,实现了特定结构肝素寡糖的定向合成,但现有单纯化学合成策略存在反应步数多、合成效率极低等不足。课题组前期通过模拟肝素的体内生物合成途径,成功发展了一种以多酶催化反应为主的、温和的化学方法为辅的化学酶法合成方法,这种全新的技术具有步骤少、产率高等优点,被认为是最具有发展前途的肝素寡糖合成策略。因此,本课题以之前建立的化学酶法合成技术为基础,有针对性地引入温和的化学修饰方法对合成特定寡糖进行N-脱硫酸化修饰以突破修饰酶对底物识别的限制,从而构建结构更加丰富的肝素寡糖化合物库。此外,肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)产生的肝素酶Ⅰ(heparinase Ⅰ)是表征肝素/HS结构、制备低分子量肝素及寡糖的工具酶之一,但之前以结构不均一的肝素及其衍生物为底物确定的底物特异性不够准确,故本论文通过全面测定肝素酶Ⅰ对合成的、结构确定的肝素寡糖的降解作用,首次发现该酶对多种不同的糖苷键均具反应活性,并阐明了酶的催化活性与底物修饰模式的关系;最后利用生物膜层干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)分析不同寡糖底物与肝素酶1的亲和力大小。本研究清晰阐明了肝素酶Ⅰ的多样化催化切割模式,为拓展肝素酶的应用奠定了基础。本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:1.糖基供体与硫酸基供体的制备肝素寡糖合成需要稀有的糖基供体UDP-GlcNTFA、UDP-GlcA及硫酸基供体PAPS,均采用本实验室建立的酶法或化学酶法合成、离子交换柱层析纯化制备,所得产物的纯度均>95%,制备规模达克级以上。所用酶包括NahK、GlmU、PPA、KAST/APSK均为大肠杆菌(E.coli)表达、亲和柱层析制得。2.肝素寡糖的合成、纯化及结构表征以对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料,在糖基转移酶KfiA或PmHS2的催化作用下,于其非还原端交替添加GlcNTFA或GlcA得到肝素寡糖骨架,每步反应产率高达96%;经反相C18柱层析纯化,得到纯度高于90%的寡糖骨架。含GlcNTFA的寡糖利用LiOH脱除叁氟乙酰基后,以PAPS为硫酸基供体,由N-硫酸基转移酶(NST)催化合成N-硫酸化肝素寡糖。然后在C5异构化酶的催化作用下,使寡糖链中介于两个N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的GlcA残基转变为IdOA,或者在C5异构化酶和2-O-硫酸基转移酶(2-OST)的共同催化下,使GlcA残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),所得到两种寡糖的产率分别为40%和80%,纯度均高达92%以上。最后在6-O-硫酸基转移酶1/3(6-OST1/3)的催化作用下,寡糖的GlcNS发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S),得到的叁种寡糖产物的产率均高于98%,纯度均高达95%以上。此外,为突破修饰酶对底物识别的限制,以温和的化学法对合成的寡糖进行N-脱硫酸化,得到四种含N-非取代GlcN(GlcNH2)的肝素寡糖,产率分别为98%、70%、73%、65%,经离子交换柱层析纯化后的寡糖纯度均高达95%以上。ESI-MS及NMR分析表明不同修饰模式的肝素寡糖产物的结构正确。3.肝素酶Ⅰ的催化切割模式的研究以合成的一系列结构确定的肝素/HS寡糖为底物,利用HPLC、ESI-MS测定肝素酶Ⅰ在不同条件下对底物的切割作用,以探究酶对不同底物的催化特性。研究结果如下:(U)肝素酶Ⅰ不能切割N-非取代GlcN(GlcNH2)与糖醛酸之间的糖苷键(GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH26S-IdoA 或GlcNH26S-IdoA2S),结合文献报道-GlcNAc6S-IdoA2S能被酶切割,因此N-取代GlcN(GlcNS或GlcNAc)是肝素酶Ⅰ切割必需的。除含-GlcNS6S-IdoA2S-的肝素寡糖,我们发现肝素酶Ⅰ还能够切割含-GlcNS6S-GlcA2S-、-GGcNS-IdOA2S-、-GlcNS-GlcA2S、-GlcNS6S-IdoA-、GlcNS6S-GlcA-糖苷键的不同寡糖,这一结果表明2-6?-硫酸化糖醛酸和6-O-硫酸化葡糖胺(GlcNS6S)不是肝素酶Ⅰ切割必需的。(2)肝素酶Ⅰ对六种肝素寡糖底物的切割效率存在较大差异,其对高硫酸化寡糖底物的切割效率显着高于低硫酸化底物,对含IdoA残基的寡糖底物的切割效率高于含GlcA残基的底物。HPLC制备酶切割产生的含不饱和糖醛酸(AUA)的产物,经ESI-MS鉴定确定六种肝素寡糖的切割位点。(3)BLI结果表明不同寡糖与肝素酶Ⅰ的亲和力大小存在差异。五糖Penta-NS与肝素酶Ⅰ的亲和力最低,与其不是肝素酶Ⅰ的底物一致;;五糖Penta-NS6S-IdoA2S、六糖Hexa-NS6S-GlcA2S与肝素酶Ⅰ的亲和力分别高于Penta-NS-IdoA2S、Hexa-NS-GlcA2S,表明高硫酸化底物被肝素酶Ⅰ裂解的效率高与其亲和力高有关;Penta-NS6S-IdoA比Penta-NS6S的亲和力高,证实含有IdoA的肝素寡糖与肝素酶Ⅰ亲和力更高,使其成为更好的底物;然而,反应活性较低的Hexa-NS6S-GlcA2A与酶的亲和力比Penta-NS6S-IdoA2S强,说明糖链更长的底物有助于与酶结合力,但无法提高可切割序列进入活性中心的能力。因此,肝素酶Ⅰ对不同肝素寡糖水解效率不是单纯由二者之间的亲和力差异决定的,而是由寡糖链长短、糖醛酸类型及分子电荷形成的整体构象的差异决定。总之,肝素酶Ⅰ对合成的不同肝素寡糖的催化切割模式对于更加准确地测定肝素/HS的结构、建立更可靠的LMWH生产工艺具有重要的借鉴意义。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-24）
桑迎春[2]（2019）在《肝素寡糖的合成研究》一文中研究指出肝素是由糖醛酸和葡糖胺的二糖重复单元通过1,4-糖苷键连接构成的线性硫酸化多糖,属于糖胺聚糖家族。肝素主要存在于肥大细胞中,可以从猪肠和牛肺中分离得到。肝素可以与几百种蛋白质选择性的结合,在众多重要的生理过程中发挥多种作用,参与包括机体的生长和发育、伤口愈合、免疫应答、血管生成、细胞黏附、调节肿瘤生长肿瘤转移、凝血、信号转导、脂质代谢辅助抗病毒和细菌感染等众多病理过程。肝素最早于1917年被分离出来,是临床中应用最为广泛的一种抗凝血药物。肝素糖链结构的不均一性限制了肝素与蛋白质相互作用研究的进展,获得多种具有明确结构的肝素寡糖是解决这一难题的有效途径。糖是多羟基醛酮类化合物,在传统的糖合成步骤中,除了糖基化反应和端基的活化之外,其余大多数的化学操作就是保护基的引进、替换以及脱去,这些操作所占的比例达到70-90%。所以可以说,寡糖的合成化学就是保护基的化学。肝素类寡糖的结构繁多复杂,它的化学合成一直以来都是有机合成中最具挑战性的。本课题完成了多种正交保护的肝素二糖重复单元的化学全合成,主要解决了以下问题:(1)GlcN模块和糖醛酸之间1,2-cis-α-糖苷键的立体选择性构建,因为缺少邻基参与作用,2-脱氧-2-氨基葡萄糖给体的1,2-cis-糖苷化的立体选择性一直是肝素寡糖化学合成中的一个难题。本课题在C-6位羟基安装空间位阻大的TBDPS基团,利于生成1,2-cis-α-糖苷键。(2)正交保护基的选择。肝素结构序列中的羟基有不同的硫酸化分布形式,GlcN上的氨基可以被硫酸化或乙酰化修饰。要区分这些不同的氨基和羟基,以防止硫酸化时相互干扰。糖基化位点保护基的选择影响到糖链主干的延伸,这就需要对保护基的选择进行分析筛选。此外还要考虑保护基对供体和受体反应活性大小的影响、糖苷键形成时是否需要引入避免邻基参与的基团、以及糖链主干延伸时糖基化位点上羟基保护基的选择等众多因素。(3)对糖链的延伸位点筛选了叁种不同的保护基,包括苄基(Bn)、2-萘醛基(2-NAP)和对甲基苄基(PMB)。其保护效果由好到差表现为PMB>Bn>2-NAP。(4)筛选了不同的糖苷化的促进体系,其中预活化促进体系中对甲基苯硫氯(p-TolSCl)、叁氟甲磺酸银(AgOTf)配合2,4,6-叁叔丁基嘧啶(TTBP)的效果最好。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-20）
邵萌,刘纯慧[3]（2018）在《肝素寡糖的合成及其对血管生成的调节作用研究进展》一文中研究指出肝素作为抗凝药物应用于临床已达80年,至今发挥着无可替代的重要作用。另一方面,肝素及其衍生物显着的抗肿瘤作用亦受到越来越多的关注和重视,其对血管生成的抑制作用被认为是主要机制之一,但微观结构的高度不均一性是研究肝素影响血管生成结构基础不得不面对的一个巨大挑战。近年涌现出的新的寡糖合成策略使制备结构确定且多样化的肝素寡糖成为可能。该文简要总结了目前已经发展的肝素寡糖合成的策略,以及肝素与血管生成相关因子相互作用的结构基础,以期为发现靶向血管生成的肝素类肿瘤治疗药物提供有价值的借鉴。(本文来源于《药物生物技术》期刊2018年03期）
邵萌[4]（2018）在《长链肝素寡糖的合成及其与碱性成纤维细胞生长因子的相互作用研究》一文中研究指出抗凝药物肝素(heparin,HP)及其结构类似物硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)都是高度硫酸化糖胺聚糖家族的成员,大量分布于哺乳动物细胞表面和细胞外基质。HS/HP通过糖链中大量不同的精细寡糖片段与肝素结合蛋白(heparin binding proteins,HBPs)相互作用,在凝血、胚胎发育、细胞分化和肿瘤发生发展等过程中起着重要的调节作用。目前发现的HBPs已经超过300种,其中与血管生成(angiogenesis)有关的包括成纤维细胞生长因子(FGFs)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、内皮抑素(ES)等。探究肝素与血管生成各因子相互作用的结构基础,有助于阐明肝素的抗肿瘤转移机制。然而,高度不均一的微观结构对深入阐明天然肝素在血管生成中的作用始终是一个巨大挑战。最近,肝素寡糖的合成取得了长足进展,涌现出了许多新的合成方法和策略,为制备结构多样的肝素寡糖奠定了坚实的基础。本课题利用前期建立的化学酶法合成策略,设计、合成了一系列结构复杂的长链肝素寡糖;然后利用亲和层析技术探究了肝素寡糖与碱性FGF(bFGF)的肝素结合域之间的亲和相互作用,以期揭示肝素与bFGF相互作用的结构基础,为发现靶向血管生成的抗肿瘤肝素寡糖类创新药物奠定基础。本学位论文取得的成果和结论包括以下几个方面:1.糖基供体和硫酸基供体的规模化制备及结构表征尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(uridine 5'-diphosphate glucuronic acid,UDP-G1cA)是以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-G1c)为原料,在UDP-G1c脱氢酶(UDP-G1c DH)和L-乳酸脱氢酶(LDH)双酶催化作用下合成的;尿苷二磷酸-N-叁氟乙酰氨基葡萄糖(uridine 5'-diphosphate-N-trifluoroacetylglucosamine,UDP-G1cNTFA)和尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(uridine 5'-diphosphate-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)是以N-叁氟乙酰氨基葡萄糖(G1cNTFA)或N-乙酰氨基葡萄糖(G1cNAc)为原料,在N-乙酰氨基葡萄糖1-激酶(NahK)、N-乙酰氨基葡萄糖尿苷转移酶(G1mU)和无机焦磷酸化酶(PPA)的共同催化下经过一步反应合成的。以叁磷酸腺苷(ATP)及硫酸钠为原料,在ATP硫酸化酶-APS激酶(KAST-APSK)及PPA共同催化下,利用一锅多酶法合成腺苷3'-磷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate,PAPS)。以上四种供体均采用Q-Sepharose强阴离子交换柱层析分离纯化,合成的规模均达克级,HPLC鉴定纯度均>95%。2.肝素六糖的合成、纯化及结构表征肝素六糖的合成中,我们利用带有UV标签的4-对硝基苯基葡萄糖醛酸(G1cA-PNP)为起始原料,在糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替催化下,以UDP-G1cNTFA(或UDP-G1cNAc)和UDP-G1cA为糖基供体,使骨架糖链自非还原端延长,经反相C18柱分离纯化得到纯度为95%以上的六糖骨架;骨架寡糖脱除叁氟乙酰基后,经N-硫酸基转移酶(NST)的催化作用,PAPS作为硫酸基供体,以81%的产率得到了 N-硫酸化的肝素六糖(6mer-1);接下来在C5-异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(20ST)的双酶催化作用下,使G1cA残基直接转换为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),以66%的产率得到了含IdoA2S的肝素六糖(6mer-2);最后由6-0-硫酸基转移酶(60ST)催化使葡萄糖胺的6-OH发生硫酸化,以65%的产率得到了 6-O-硫酸化肝素六糖(6mer-3)。6mer-1、6mer-2、6mer-3 均经 Q-Sepharose 强阴离子交换柱分离纯化得到,纯度均在99%以上,制备规模均达百毫克级,ESI-MS和NMR分析其结构正确。3.肝素八糖的合成、纯化及结构表征肝素八糖的合成中,以G1cA-PNP为起始原料,利用糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替催化作用合成、C18柱分离纯化得到纯度达95%的八糖骨架;脱除叁氟乙酰基并在NST的催化下以66%的产率得到了 N-硫酸化肝素八糖(8mer-1);尝试对含有两个可异构化/2-O-硫酸化的G1cA位点的肝素八糖同时进行修饰反应,首次成功地以44%的总产率得到了含两个IdoA2S的肝素八糖(8mer-2);最后在60ST作用下合成了 6-0-硫酸化肝素八糖(8mer-3),反应总产率40%。此外,对N-硫酸化的肝素八糖8mer-1直接进行6-O-硫酸化修饰,得到仅含G1cA不含IdoA2S的6-O-硫酸化的肝素八糖(8mer-4),反应产率达64%。反应均以强阴离子交换柱分离纯化,四种肝素八糖纯度均在95%以上,ESI-MS和NMR分析其结构正确。4.肝素十糖的合成、纯化及结构表征在肝素十糖的合成中,同样以G1cA-PNP为起始原料,利用糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替作用合成、C18柱分离纯化得九糖骨架;依次进行NST和KfiA催化的反应,以60%的终产率得到了 N-硫酸化的肝素十糖(1Omer-1);最后进行60ST催化反应,以52%的的产率得到6-0-硫酸化的肝素十糖(1Omer-2)。反应均经强阴离子交换柱分离纯化,HPLC鉴定两种十糖的纯度均在95%以上,ESI-MS和NMR分析其结构正确。5.肝素寡糖与FGF2相互作用的初步研究利用亲和层析技术,分析上述长链寡糖与FGF2的肝素结合域之间的结合力大小的差异,初步揭示了肝素寡糖与FGF2作用的可能结构特点:寡糖链的长度以及寡糖的2-O-硫酸化和6-0-硫酸化可能同时影响着其与FGF2的亲和力大小。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-20）
胡贵新[5]（2017）在《不同修饰模式的肝素寡糖的化学酶法合成及肝素酶的底物特异性研究》一文中研究指出肝素和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)是由氨基葡萄糖(GlcN)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)以1→4糖苷键连接而成的二糖单元组成的糖胺聚糖,二糖单元的多个位置可以被硫酸化修饰,因此结构极其复杂。肝素/HS中丰富的寡糖序列是其表现出多种多样的生物活性的结构基础。针对天然肝素的动物源性和结构不均一性造成的安全隐患,合成结构确定的肝素/HS寡糖受到越来越多重视。单纯化学法合成尽管进展迅速,但仍面临合成步骤多、产率低等挑战。最近发展的化学酶法策略因具有立体选择性强、产率高等优点,有望发展成为一种理想的肝素和HS寡糖的合成新技术。因此,本课题拟利用化学酶法合成具有不同硫酸化模式的肝素寡糖。此外,细菌来源的肝素酶(heparinases或heparin lyases)能够通过β-消除机制降解肝素及HS,是表征其结构和制备低分子量寡糖的重要工具酶。但是,之前的研究多以肝素及其衍生物为底物探究其催化机制和切割活性,结构不均一的多糖底物很可能对酶解活性产生干扰,极大增大了产物分析的难度,更难以清晰阐明肝素酶作用于不同切割位点时的差异。因此,本课题根据肝素酶可能的切割位点设计、合成一系列结构均一确定的HS寡糖作为底物,并深入探究叁种肝素酶的底物适应性,为拓展肝素酶的应用奠定基础。本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:1.糖基供体和硫酸基供体的规模化制备利用N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-叁氟乙酰氨基葡萄糖(GlcNTFA)、ATP、UTP为原料,在叁种重组酶NahK、GlmU、PPA的共同催化作用下合成尿苷二磷酸(UDP)-GlcNTFA/UDP-GlcNAc;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为原料,由UDP-Glc脱氢酶、乳酸脱氢酶(LDH)催化合成UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)。经强离子交换柱层析纯化后,糖基供体的纯度可达98%以上,制备规模可达克级。以Na2SO4、ATP为原料,利用ATP硫酸化酶、APS激酶催化合成硫酸基供体PAPS,纯化后的产物纯度达99%,制备规模达到克级。2.肝素六糖的合成、纯化及结构表征以对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料,利用糖基转移酶KfiA或PmHS2的催化,在其非还原端交替添加GlcNTFA(GlcNAc)或GlcA得到HS六糖骨架,每步反应产率高达98%,经反相C18柱层析纯化,得到纯度高于90%的六糖骨架,合成规模达百毫克级。利用LiOH脱除叁氟乙酰基后,以PAPS为硫酸基供体,由N-硫酸基转移酶(NST)催化合成N-硫酸化六糖。然后在C5异构化酶和2-O硫酸基转移酶(2-OST)的共同催化下,使糖链中介于两个N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的GlcA残基转变为2-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)。最后由6-O硫酸基转移酶1/3(6-OST1/3)催化使寡糖的GlcNS或GlcNAc发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S或GlcNAc6S)。叁种硫酸化修饰模式的肝素寡糖产率分别为99%、72%、99%,经离子交换柱层析纯化后的寡糖纯度均高达99%,合成规模达到百毫克级。ESI-MS及NMR分析表明不同修饰模式的肝素六糖产物的结构均正确。3.肝素酶的底物特异性研究根据肝素酶可能的切割位点设计、并利用化学酶法合成了一系列结构确定的肝素及HS寡糖,HPLC分析其纯度>90%,ESI-MS测定表明结构的正确性。以合成的寡糖为底物,利用HPLC分析测定肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在不同条件下对它们的切割作用,以探究酶对不同底物的催化特异性。同时利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术初步研究了肝素酶Ⅲ与不同HS寡糖底物的相互作用。研究结果表明:(1)肝素酶Ⅰ不能切割GlcN与非硫酸化糖醛酸之间的糖苷键位点(GlcN-GlcA或GlcN-IdoA),仅能切割-GlcNS-IdoA2S-,-GlcNS6S3S-IdoA2S-、-GlcNS-GlcA2S-之间的糖苷键,这一结果表明2-O-硫酸化糖醛酸(UA2S)是肝素酶Ⅰ切割必需的,而GlcN的6-O-或3-O-硫酸化修饰对切割作用影响不大。(2)肝素酶Ⅲ可以切割含主要切割位点(GlcNAc-GlcA或GlcNS-GlcA)的叁糖底物(Tri-NAc或Tri-NS),但对Tri-NAc的催化效率显着高于Tri-NS。肝素酶Ⅲ能够耐受含不同修饰的GlcN(GlcNH2、GlcNAc6S及GlcNS6S)与GlcA之间的次要切割糖苷键,但催化效率显着低于对应的主要叁糖底物,提示N-非取代或6-O-硫酸化修饰均会降低肝素酶Ⅲ对HS寡糖底物的反应活性。肝素酶Ⅲ对含IdoA的次要切割位点(GlcNS-IdoA)的反应效率在反应初期低于主要位点GlcNS-GlcA,但总体差别不大。HS寡糖中的IdoA2S大大降低肝素酶Ⅲ对其还原端相邻的GlcNS-GlcA位点的切割效率,但是对其非还原端的位点的影响不大。肝素酶Ⅲ对底物的特异性强弱与底物分子大小有关的,即其对分子量越大的底物切割效率越高。肝素酶Ⅲ对含有多个位点的HS寡糖中的切割次序为随机切割,这与内切酶的特性相一致;但是相比于还原端和非还原端,肝素酶Ⅲ对内部糖苷键具有更高的切割偏好性。SPR分析表明,单纯通过酶与底物间亲和力大小来判断酶对底物切割效率并不完全可取,因为寡糖底物结构、带电荷情况极其复杂,从而可能会导致寡糖底物与酶的错误结合而阻碍催化反应。(3)肝素酶Ⅱ能够切割含肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ作用位点的寡糖;除对含-GlcNS6S-GlcA-位点的寡糖切割效率高于肝素酶Ⅲ,肝素酶Ⅱ对其他含肝素酶Ⅲ作用位点寡糖的反应活性低于肝素酶Ⅲ;肝素酶Ⅱ对肝素酶Ⅰ的作用位点的催化效率与肝素酶Ⅰ相当,均高于对GlcNS-GlcA的作用。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-24）
邓广秀[6]（2017）在《肝素寡糖与β-淀粉样蛋白相互作用的核磁共振研究》一文中研究指出阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性发展的神经功能障碍性疾病,老年人是其主要的发病人群。随着人口老龄化情况加剧,阿尔兹海默症已经逐渐成为严重危害老年人健康的常见病。β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)是AD病理性标志淀粉样斑块的重要组成部分,tau蛋白是神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFTs)的主要组成部分,而淀粉样斑块和NFTs是神经病理学诊断AD的标准。但是,NFTs在很多神经退行性疾病中观察到,因此,β-淀粉样蛋白成为研究AD的主要物质。人类终身产生Aβ,它是一种正常的生理代谢产物,其不正常的病理变化是引发AD的重要原因。研究发现,糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)介导了Aβ的聚集并导致神经毒性的发生,硫酸化的GAG能够有效促进Aβ的纤维化聚集,并且稳定已形成的老年斑,但是未硫酸化的透明质酸(hyaluronic acid,HA)不能够促进Aβ聚集。而肝素寡糖与Aβ结合可以有效的抑制Aβ的聚集并减少其神经毒性。肝素寡糖不具有毒性且能够通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)直接作用于Aβ。肝素寡糖混合物C3是一种低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)衍生物,它是一种Aβ聚集抑制剂,已在临床治疗中应用。然而该药物是一种混合物,由于肝素可以与近百种蛋白质相互作用并发挥不同的生理活性,混合物可能存在潜在的副作用,因此,需进一步明确研究肝素寡糖与Aβ之间相互作用的构效关系。本课题旨在研究不同硫酸化程度及硫酸化位点的肝素寡糖与Aβ之间的相互作用的差异性,从分子水平上研究明确结构的寡糖与Aβ40结合的构效关系。运用质谱(mass spectrum,MS)和核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)分析方法分别对制备的叁种肝素四糖dp4-1、dp4-3、dp4-4和市售的磺达肝癸钠(肝素五糖片段)进行了结构表征,确定了叁种肝素四糖结构分别为:ΔUA2S(1 →4)GlcNS6S(1 →4)IdoA2S(1 →4)GlcNS,ΔUA2S(1 →4)GlcNS6S(1 →4)GlcA(1→4)GlcNS6S,ΔUA2S(1→4)GlcNS6S(1→4)IdoA2S(1→4)GlcNS6S.五糖的结构为GlcNS6S(1 →4)GlcA(1→4)GlcNS3S6S(1→4)IdoA2S(1→4)GlcNS6SOMe。利用凝胶迁移速率分析(gel mobility shift assay,GMSA)优化寡糖与Aβ相互作用的最适条件,根据实验结果分析肝素四糖与Aβ相互作用强弱顺序为:dp4-4>dp4-1>dp4-3。利用NMR分析方法研究寡糖与Aβ结合的明确位点,结果表明肝素寡糖结构中IdoA2S为必要的结合位点,而GlcNS6S中的6S对两者的相互作用起到增强的作用,而磺达肝癸钠中具有特异性抗凝活性的3S结构并未参与两者相互作用。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-08）
张玲玲,季璇馨,刘洁茹,黄青林,何书英[7]（2016）在《肝素寡糖对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响及分子机制研究》一文中研究指出以脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs炎症损伤,探讨肝素寡糖对炎症的影响及其分子机制。实验分为空白组(0.5%血清培养基)、模型组(LPS+0.5%血清培养基)及给药组(LPS+0.5%血清培养基+0.01、0.1、1μmol/L HDO),采用活性氧实验检测细胞内活性氧簇水平,Western blot检测VCAM-1、p38、p-p38及核转录因子NF-κB等关键蛋白的表达水平。结果显示0.01、0.1和1μmol/L的HDO可抑制100μg/m L LPS诱导的HUVECs炎症因子VCAM-1表达水平,较弱的影响细胞中NF-κB分布,并下调信号通路中关键蛋白p38和p-p38表达。结果表明,HDO可能通过抑制炎症信号通路中关键蛋白的表达水平来抑制炎症因子的表达,从而起到抗炎作用。(本文来源于《中国药科大学学报》期刊2016年05期）
张晓,单鑫迪,赵小亮,李国云,王小江[8]（2016）在《低抗凝肝素寡糖的制备、结构表征及免疫活性评价》一文中研究指出以猪肠黏膜来源低抗凝肝素为原料,采用苄酯碱水解法制备了寡糖.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)-多角激光光散射法(MALLs)联用、核磁共振波谱(NMR)和液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术对所制备寡糖的分子量分布及化学结构进行了表征.以该寡糖对活化X因子(FXa)及人凝血酶(FⅡa)活性的抑制作用评价了其抗凝血活性,并通过测定其对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力及NO释放量的影响评价其免疫活性.结果表明,所制备寡糖的聚合度分布于2~22之间,平均分子质量为5300,无明显的抗凝血活性,但具有显着的免疫增强活性.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2016年07期）
梁群焘[9]（2016）在《含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH_3~+）肝素寡糖库的建立与一级结构测定及其LC/MS-IT-TOF裂解规律的研究》一文中研究指出生物体内含稀少N-非取代葡萄糖胺残基(GlcNH3+)结构的硫酸类肝素(HS)具有重要的生物学和病理生理学功能。但这种HS在生物体内含量少,要获得生物体内含GlcNH3+结构的HS对其结构研究分析很困难。本论文用化学方法建立了与生物体内结构类似的肝素(heparin)/HS寡糖糖库,并建立了一种灵敏有效的heparin/HS寡糖测序方法,对库中寡糖系列作了分析,同时初步探讨了含不同GlcNH3+数目肝素寡糖在LC/MS-IT-TOF分析中的裂解规律,期望为检测研究生物体内HS结构与功能奠定基础。本论文主要由六个章节组成。第一章着重介绍了含GlcNH3+残基heparin/HS寡糖相关的基本知识,寡糖结构表征的几种常用方法技术以及寡糖系列测定的现状。第二章用聚丙烯酰胺凝胶色谱从低分子量肝素中分离收集不同聚合度的肝素寡糖(dp4-dp20)。收集到的肝素四糖(dp4)和六糖(dp6)用强阴离子交换高效液相色谱进一步分析分离,结果表明它们都有叁个主要成分,分别命名为dp4A、dp4B和dp4C;dp6A、dp6B和dp6C。二糖组分鉴定结果表明dp4C和dp6C由△HexA(2S)-GlcNS(6S)组成,为高度硫酸化的肝素寡;dp4A和dp6A主要由△Hex(2S)-GlcNS和△HexA(2S)-GlcNS(6S)组成;dp4B 和 dp6B 主要由 △Hex-GlcNS(6S)和 AHexA(2S)-GlcNS(6S)组成。第叁章以高度硫酸化的肝素寡糖为原材料,用部分脱N位硫酸根的化学方法,制备了含不同GlcNH3+数目的二糖、四糖和六糖糖库;优化了生成含不同GlcNH3+寡糖的化学反应条件;接着分别用肝素酶解法,尺寸排阻色谱和反向离子对试剂色谱串联离子阱飞行时间质谱对糖库的结构进行分析检测,结果表明制备的系列含GlcNH3+寡糖纯度高,这为研究含GlcNH3+肝素/硫酸类肝素寡糖的结构和功能提供重要的保障。第四章建立验证了一种简单灵敏有效的寡糖测序方法,能对含GlcNH3+的HS/heparin寡糖系列进行测定。这种寡糖系列测定方法包括HNO2(pH 4.0)裂解,尺寸排阻色谱(SE-HPLC)和反向离子对试剂色谱串联离子阱飞行时间质谱(RPIP-LC/MS-IT-TOF)。在HPLC分析过程中,我们发现在非还原端糖醛酸片段上C4-C5饱和的寡糖,在紫外(UV)232 nm处有足够被检测到的吸收(UV 232 nm常用来特异地检测C4-C5位置具有不饱和双键的寡糖),这发现能简化定位GlcNH3+基团的方法。RPIP-LC/MS-IT-TOF系统能为寡糖的全序列测定提供很多的结构信息。本实验建立的新方法被用来分离和系列测定多种肝素六糖混合物,这些六糖是化学方法生成的且在不同的位置含有1个到3个GlcNH3+基团。这种方法为测定生物体中含GlcNH3+的HS寡糖系列提供可能。对这方法作一些细微的改变,即改用pH 1.5的HNO2裂解N位硫酸基团,也能够对一些其它HS糖链进行系列测定。第五章众所周知,在非还原端饱和结构的heparin/HS寡糖没有UV232nm吸收(一般UV 232 nm吸收特异地用来检测C4-C5不饱和结构的寡糖),这对其结构分析带来不便。然而我们的研究发现饱和的肝素寡糖在UV 232 nm处有足以被检测到的吸收。为了进一步研究饱和结构寡糖在UV 232 nm处的吸收情况,制备了四种饱和结构的肝素二糖,后用RPIP-LC/MS-IT-TOF的光电二极管阵列检测器分析它们UV 232 nm吸收情况,结果显示饱和肝素二糖在UV 232 nm处有足够被检测到的吸收,强度大约为不饱和肝素二糖UV 232 nm吸收强度的7%-40%;硫酸基团会影响UV 232 nm的吸收强度。此外,比较不饱和结构heparin/HS二糖的UV 232 nm吸收,结果表明含GlcNH3+结构的二糖对UV 232 nm比较不敏感性。最后,我们通过简单的UV检测方法,结合HN02(pH 4.0)裂解和RPIP-LC/MS-IT-TOF分析,简化了N-非取代dp6寡糖的测序方法。这方法改用HN02(pH 1.5)裂解为测定含N-硫酸基团寡糖序列提供可能。第六章用LC/MS-IT-TOF分析检测了系列含不同GlcNH3+数目的肝素四糖(dp4)和六糖(dp6)。提取离子流图(Extracted Ion Chromatogram,EIC)-MS和MS2分析结果表明,含不同GlcNH3+数目的肝素寡糖具有不同的裂解规律,这为MS方法进一步鉴定和定量含GlcNH3+结构的寡糖奠定了基础。(本文来源于《福州大学》期刊2016-06-01）
纪小虎[10]（2016）在《硫酸乙酰肝素寡糖的化学酶法合成及其液相色谱—质谱联用初步分析研究》一文中研究指出硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)属于糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)家族,抗凝药物肝素(heparin, HP)为HS的特殊形式。HS广泛存在于哺乳动物的细胞表面和细胞外基质,通过与核心蛋白的丝氨酸／苏氨酸残基共价结合形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)微观结构高度不均一的HS可与大量不同的肝素结合蛋白(heparin binding proteins, HBPs)相互作用,参与或调节凝血、炎症反应、病原微生物感染、细胞增殖分化等诸多生物过程,因此,结构确定的HS寡糖是新型创新药物的重要先导化合物。由于HS结构的高度复杂性,化学法合成HS/HP寡糖面临反应步数多、合成效率低等挑战。美国北卡大学教堂山分校的刘建(Jian Liu)教授通过模拟HS/HP的生物合成过程发展了一种全新的化学酶法合成技术,被认为是当前高效合成多样化HS寡糖的理想策略。因此,本课题首先利用酶法制备得到了合成所必需的糖基供体尿苷二磷酸N-(叁氟)乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc/TFA)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcAc)以及硫酸基供体腺苷3’-磷酸5’-磷酰硫酸(PAPS)；重点利用化学酶法合成了结构确定的不同HS骨架寡糖以及N-硫酸化、和6-O-硫酸化的HS寡糖；最后建立了HS寡糖的高效液相色谱-电雾式检测-质谱(HPLC-CAD-MS)联用分析方法。本论文取得的主要研究成果如下：1.糖基供体的酶法合成及规模化制备以N-乙酰氨基葡萄(GlcNAc)(或N-叁氟乙酰氨基葡萄,GlcNTFA)为原料,经大肠杆菌表达的N-乙酰氨基葡萄1-激酶(NahK)、N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶(GlmU)和无机焦磷酸化酶(PPA)共同催化一步合成了UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为原料,经牛肝UDP-Glc脱氢酶(UDP-Glc DH)和L-乳酸脱氢酶(LDH)双酶催化合成UDP-GlcA;用强阴离子交换柱层析纯化得到单一化合物,HPLC-多氨柱(PAMN)鉴定纯度>95%,叁种糖基供体制备规模达到克级。2.硫酸基供体的酶法合成及规模化制备以叁磷酸腺苷(ATP)及硫酸根离子为原料,在大肠杆菌共表达的ATP硫酸化酶-APS激酶(KAST-APSK)及PPA共同催化下一步合成PAPS;用强阴离子交换柱层析纯化得到PAPS, PAMN-HPLC鉴定纯度>90%,制备规模达到克级。3.HS骨架寡糖的酶法合成与结构表征以带UV标签的4-对硝基苯葡萄糖醛酸(GlcA-pnp)为起始原料,在N-乙酰氨基葡萄转移酶(KfiA)的催化下,以UDP-GlcNAc(或UDP-GlcNTFA)为糖基供体,向其非还端添加GlcNAc(或GlcNTFA),用PAMN-HPLC检测确定反应终点(产率>95%),用C18填料纯化得到二糖；然后在Pasteurella multocida heparosan合成酶PmHS2的催化下,以UDP-GlcA为糖基供体,向二糖非还端添加GlcA, PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用C18填料纯化得叁糖；依次重复上述步骤,得到15种结构确定的不同HS骨架寡糖。ESI-MS及1HNMR验证了所得HS寡糖的结构。4.N-硫酸化的HS寡糖的化学酶法合成与结构表征以含叁氟乙酰基(TFA)的HS叁糖骨架为起始原料,用LiOH处理使GlcNTFA脱去TFA形成葡萄糖胺(GlcNH2),然后以PAPS为硫酸基供体,在N-硫酸基转移酶(NST)催化下对寡糖进行N-硫酸化(NS)修饰。以PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用强阴离子交换层析纯化,得到N-硫酸化的HS叁糖(NS-3mer) 。 HPLC分析显示产物纯度大于99%,ESI-MS及1HNMR验证NS产物的结构。5.6-O-硫酸化的HS寡糖的酶法合成以上步NS-3mer为起始原料,以PAPS作为硫酸基供体,在6-O-硫酸基转移酶1和3(6-OST1/3)催化下对寡糖进行6-O-硫酸化(6S)修饰,PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用强阴离子交换层析纯化得到6-O-硫酸化的叁糖(NS6S-3mer) 。 HPLC分析显示产物纯度大于99%,ESI-MS及1HNMR验证了6S产物的结构。类似地,以含TFA基团的HS骨架五糖、六糖为原料,依次重复上述NS及6S修饰过程,得到了NS修饰和NS6S修饰的HS五糖及六糖,HPLC鉴定纯度均大于95%,ESI-MS及1HNMR验证了产物的结构。6.HS骨架寡糖的HPLC-CAD/MS分析方法的建立针对HS寡糖在分离与鉴定中存在的困难,在HPLC-CAD体系下,分析不同色谱条件下HS骨架寡糖(二糖-八糖)在多孔石墨碳(PGC)色谱柱上的保留行为,首次以等度洗脱实现了七种寡糖的同时基线分离,最佳色谱条件为：流动相为乙腈/水/甲醇/叁氟乙酸(48/48/4/0.2,v/v),流速为0.4 ml/min,温度25。C。将建立的分离方法直接移植到HPLC-MS体系中,实现7种HS寡糖的定性分析。(本文来源于《山东大学》期刊2016-04-01）
肝素寡糖论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肝素是由糖醛酸和葡糖胺的二糖重复单元通过1,4-糖苷键连接构成的线性硫酸化多糖,属于糖胺聚糖家族。肝素主要存在于肥大细胞中,可以从猪肠和牛肺中分离得到。肝素可以与几百种蛋白质选择性的结合,在众多重要的生理过程中发挥多种作用,参与包括机体的生长和发育、伤口愈合、免疫应答、血管生成、细胞黏附、调节肿瘤生长肿瘤转移、凝血、信号转导、脂质代谢辅助抗病毒和细菌感染等众多病理过程。肝素最早于1917年被分离出来,是临床中应用最为广泛的一种抗凝血药物。肝素糖链结构的不均一性限制了肝素与蛋白质相互作用研究的进展,获得多种具有明确结构的肝素寡糖是解决这一难题的有效途径。糖是多羟基醛酮类化合物,在传统的糖合成步骤中,除了糖基化反应和端基的活化之外,其余大多数的化学操作就是保护基的引进、替换以及脱去,这些操作所占的比例达到70-90%。所以可以说,寡糖的合成化学就是保护基的化学。肝素类寡糖的结构繁多复杂,它的化学合成一直以来都是有机合成中最具挑战性的。本课题完成了多种正交保护的肝素二糖重复单元的化学全合成,主要解决了以下问题:(1)GlcN模块和糖醛酸之间1,2-cis-α-糖苷键的立体选择性构建,因为缺少邻基参与作用,2-脱氧-2-氨基葡萄糖给体的1,2-cis-糖苷化的立体选择性一直是肝素寡糖化学合成中的一个难题。本课题在C-6位羟基安装空间位阻大的TBDPS基团,利于生成1,2-cis-α-糖苷键。(2)正交保护基的选择。肝素结构序列中的羟基有不同的硫酸化分布形式,GlcN上的氨基可以被硫酸化或乙酰化修饰。要区分这些不同的氨基和羟基,以防止硫酸化时相互干扰。糖基化位点保护基的选择影响到糖链主干的延伸,这就需要对保护基的选择进行分析筛选。此外还要考虑保护基对供体和受体反应活性大小的影响、糖苷键形成时是否需要引入避免邻基参与的基团、以及糖链主干延伸时糖基化位点上羟基保护基的选择等众多因素。(3)对糖链的延伸位点筛选了叁种不同的保护基,包括苄基(Bn)、2-萘醛基(2-NAP)和对甲基苄基(PMB)。其保护效果由好到差表现为PMB>Bn>2-NAP。(4)筛选了不同的糖苷化的促进体系,其中预活化促进体系中对甲基苯硫氯(p-TolSCl)、叁氟甲磺酸银(AgOTf)配合2,4,6-叁叔丁基嘧啶(TTBP)的效果最好。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肝素寡糖论文参考文献
[1].张成盈.基于化学酶法合成的肝素寡糖探究肝素酶Ⅰ的催化切割模式[D].山东大学.2019
[2].桑迎春.肝素寡糖的合成研究[D].山东大学.2019
[3].邵萌,刘纯慧.肝素寡糖的合成及其对血管生成的调节作用研究进展[J].药物生物技术.2018
[4].邵萌.长链肝素寡糖的合成及其与碱性成纤维细胞生长因子的相互作用研究[D].山东大学.2018
[5].胡贵新.不同修饰模式的肝素寡糖的化学酶法合成及肝素酶的底物特异性研究[D].山东大学.2017
[6].邓广秀.肝素寡糖与β-淀粉样蛋白相互作用的核磁共振研究[D].山东大学.2017
[7].张玲玲,季璇馨,刘洁茹,黄青林,何书英.肝素寡糖对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响及分子机制研究[J].中国药科大学学报.2016
[8].张晓,单鑫迪,赵小亮,李国云,王小江.低抗凝肝素寡糖的制备、结构表征及免疫活性评价[J].高等学校化学学报.2016
[9].梁群焘.含N-非取代葡萄糖胺（GlcNH_3~+）肝素寡糖库的建立与一级结构测定及其LC/MS-IT-TOF裂解规律的研究[D].福州大学.2016
[10].纪小虎.硫酸乙酰肝素寡糖的化学酶法合成及其液相色谱—质谱联用初步分析研究[D].山东大学.2016
论文知识图
