AUF1在胞质DNA抑制细胞葡萄糖代谢中的作用研究

论文摘要

目的:探讨AUF1在胞质DNA引起的细胞葡萄糖代谢应答中的作用及其机制。方法:（1）用核质分离技术分离细胞核与细胞质,并通过生物素-亲和素亲和层析技术分离细胞质中与胞质DNA（ISD）结合的蛋白质,然后通过"银染-质谱"和"复合物-质谱"技术鉴定出差异蛋白——AUF1。再利用体外结合实验验证AUF1与胞质DNA的相互作用。（2）在胞质DNA刺激后,通过ATP检测试剂盒和CCK8细胞氧还活力检测试剂,比较野生型细胞和基于CRISPR/Cas9技术的AUF1基因敲除细胞中葡萄糖代谢应答情况。（3）通过半定量PCR技术,在野生型、基因敲除AUF1、基因敲除后回补AUF1或空载体的四类细胞中检测葡萄糖转运蛋白GLUTs以及葡萄糖代谢相关酶的mRNA表达情况,筛选出与细胞糖代谢相关的AUF1下游效应分子——GLUT3。进而用实时荧光定量PCR进行验证。（4）通过半定量和荧光定量PCR分析胞质DNA刺激下GLUT3的mRNA变化情况,分析胞质DNA的刺激是否影响GLUT3的mRNA表达。结果:（1）两次质谱分析均发现AUF1能与ISD结合。体外结合实验也证实,不论是原核表达的GST-AUF1还是真核细胞表达的GFP-AUF1均能与单链和双链的ISD相结合。（2）基因敲除AUF1后的HEK293细胞在用胞质DNA刺激后,胞内的ATP水平和对CCK8的还原能力都明显高于野生型细胞。提示AUF1基因敲除细胞内的葡萄糖代谢不受胞质DNA刺激所抑制,说明AUF1很可能参与了胞质DNA对细胞糖代谢的调节。（3）半定量PCR技术检测发现在AUF1敲除的细胞中GLUT3的mRNA明显减少,而其他的GLUT家族成员和代谢酶则没有显著差异。实时荧光定量PCR证实上述现象,提示AUF1很可能通过稳定GLUT3的mRNA参与葡萄糖代谢的调节。（4）无论是单链还是双链ISD刺激后的细胞中,GLUT3的mRNA均减少,说明GLUT3可能是胞质DNA对糖代谢的调节过程中的一个下游效应分子。结论:AUF1能与胞质DNA结合,很可能通过调节下游GLUT3的mRNA稳定性参与胞质DNA引起的糖代谢应答反应。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 病毒表达载体的构建与感染
•   1.2 基于CRISPR/Cas9细胞水平的基因敲除[15]
•   1.3 胞质DNA刺激实验[7]
•   1.4 核质分离实验[11]
•   1.5 DNA体外结合实验[16]
•   1.6 ATP水平检测[7]
•   1.7 细胞氧还能力检测[7]
•   1.8 实时荧光定量PCR[17]
• 2 结果
•   2.1 AUF1结合单链和双链ISD
•   2.2 AUF1参与胞质DNA诱导的细胞能量代谢应答
•   2.3 GLUT3受到AUF1的调控
•   2.4 胞质DNA刺激下调GLUT3 mRNA的表达
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 谢琳娜,卜静静,郑敏

关键词: 胞质,葡萄糖代谢

来源: 中国生物工程杂志 2019年11期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建生物工程职业技术学院,福建医科大学

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20191106

页码: 54-61

总页数: 8

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