高活性核桃内生真菌筛选及其代谢产物抑菌机理研究（Ⅱ）

论文摘要

核桃内生真菌具有丰富的生物多样性,为了更好地利用这种微生物资源,本研究在核桃内生真菌活性菌株筛选、发酵条件优化、代谢产物分离纯化,以及抑菌机理等方面进行研究,主要结果如下:（1）采用生长速率法,以6种常见植物病原菌为指示菌,对16株核桃内生真菌进行活性筛选。结果表明,1株来源于良种核桃树根部的内生真菌G3,其发酵产物对6种病原菌均表现出一定的抑菌活性。其中对苹果腐烂病原菌抑制率达到100%,完全抑制了病原菌菌丝生长;对水稻纹枯、核桃炭疽病原菌抑制率均大于75%。通过形态学特征观察结合分子生物学鉴定,G3确定为弯角镰刀菌Fusarium camptoceras。（2）以接种量、发酵温度和发酵天数为影响因子,以G3发酵产物对苹果腐烂病原菌的抑制率为评价指标,通过单因素试验、正交试验对核桃内生真菌G3的发酵工艺条件进行优化。结果表明,G3发酵的最优工艺为:接种量10%,发酵温度28℃,发酵时间30 d;此工艺条件下,G3发酵产物对苹果腐烂病原菌抑制率为85.17%。影响因子对抑制率的影响依次为:发酵温度>发酵天数>接种量。（3）采用液液分配方法,对核桃内生真菌G3固体发酵产物的乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。结果表明,正丁醇相和乙酸乙酯相对苹果腐烂病原菌抑制的IC50值分别为3.3 mg/mL和4.3 mg/mL;结合各萃取相质量及其对苹果腐烂病原菌抑制效果综合考虑,选择正丁醇相和乙酸乙酯相作为深入研究的活性萃取相。（4）通过对各萃取相化学成分预试验,结果显示,正丁醇相主要含有有机酸类物质,乙酸乙酯相主要为酚类物质,推测G3发酵产物活性物质可能为有机酸与酚类物质。对乙酸乙酯萃取相进行柱色谱分离获得高活性组分Fry2-2,供试浓度为1 mg/mL时,对苹果腐烂病原菌抑制率达到89.36%;GC-MS分析共检测到15种化合物,主要为胺类、脂类、酚类与烷烃类。对Fry2-2进一步分离,在Fry2-2-2组分中析出化合物A,经过重结晶纯化和核磁共振等检测,化合物A鉴定为:2,2’-亚甲基双[6-（1,1-二甲基乙基）]-4-甲基-苯酚,抑制苹果腐烂病原菌的IC50值为0.11 mg/mL。（5）在体外和体内条件下,对G3高活性组分抑制苹果腐烂病的机理进行研究。结果表明:高活性组分处理下,病原菌菌丝出现破损、撕裂,或者顶端形成纺锤形,使其生长异常,菌丝量减少;病原菌菌液的电导率增加、麦角甾醇含量降低、几丁质酶活性增加;感病苹果的体内防御酶SOD、PPO、POD活性均明显升高,高活性组分与5 mmol/L水杨酸两者处理效果相近,防御酶活性都呈现先升高后降低的趋势,并能够明显抑制苹果腐烂病斑的扩展,最大抑制率为77.61%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 内生真菌研究概况
•     1.1.1 植物内生菌研究
•     1.1.2 植物内生真菌研究现状
•     1.1.3 植物内生真菌多样性
•     1.1.4 植物内生真菌代谢产物活性
•   1.2 核桃研究概况
•     1.2.1 核桃植物的化学成分研究
•     1.2.2 核桃植物的生物活性研究
•   1.3 研究目的与意义
•   1.4 研究内容及技术路线
•     1.4.1 研究内容
•     1.4.2 技术路线
• 第二章 活性菌株筛选及高活性菌株鉴定
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 供试内生真菌
•     2.2.2 供试病原真菌
•     2.2.3 试验培养基
•     2.2.4 活性菌株筛选
•     2.2.5 高活性菌株分子鉴定
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 核桃内生真菌高活性菌株筛选
•     2.3.2 核桃内生真菌G3 的鉴定归属
•   2.4 小结
• 第三章 核桃内生真菌G3发酵工艺研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 试验菌株
•     3.2.2 培养基
•     3.2.3 内生真菌的发酵培养
•     3.2.4 固体发酵工艺单因素试验
•     3.2.5 正交试验
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 不同发酵方式对G3 发酵产物抑菌活性和醇提物质量的影响
•     3.3.2 不同接种量对G3 发酵产物抑菌活性的影响
•     3.3.3 不同发酵温度对G3 发酵产物抑菌活性的影响
•     3.3.4 不同发酵时间对G3 发酵产物抑菌活性的影响
•     3.3.5 正交试验
•   3.4 小结
• 第四章 核桃内生真菌G3代谢产物研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 供试菌株
•     4.2.2 培养基
•     4.2.3 核桃内生真菌G3 的发酵培养
•     4.2.4 发酵产物的不同极性萃取
•     4.2.5 不同极性萃取物的抑制真菌试验
•     4.2.6 抑制细菌试验
•     4.2.7 不同极性萃取物的基本化学成分测定
•     4.2.8 乙酸乙酯相与正丁醇相柱层析分离
•     4.2.9 乙酸乙酯相高活性组分分析
•     4.2.10 化合物A鉴定和活性测定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 G3 固体发酵产物不同萃取相对病原真菌的抑制作用
•     4.3.2 G3 发酵产物不同萃取相对细菌的抑制作用
•     4.3.3 不同萃取相化学成分预试验
•     4.3.4 内生真菌G3 发酵产物不同萃取相柱层析
•     4.3.5 内生真菌G3 乙酸乙酯相高活性组分GC-MS分析
•     4.3.6 化合物A结构鉴定与抑菌活性
•   4.4 小结
• 第五章 G3代谢产物对苹果腐烂病原真菌抑菌机理研究
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 供试内生真菌与病原真菌
•     5.2.2 试剂与仪器
•     5.2.3 G3 高活性组分对苹果腐烂病原菌菌丝的影响
•     5.2.4 G3 高活性组分对苹果体内酶活性影响
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 G3 高活性组分对苹果腐烂病原菌菌丝的影响
•     5.3.2 G3 高活性组分处理对苹果体内酶活性的影响
•   5.4 小结
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 惠建超

导师: 翟梅枝

关键词: 核桃,内生真菌,正交试验

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金项目(项目编号:31370052)

分类号: TS201.3;TS255.6

总页数: 76

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