一种聚乙烯塑料高效降解菌及其分离筛选方法和应用论文和设计-涂晨

全文摘要

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种聚乙烯塑料高效降解菌及其分离筛选方法和在聚乙烯塑料生物降解方面的应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo:15724；保藏时间为：2018年5月4日。该菌株具有良好的环境适应性，对聚乙烯塑料，尤其是聚乙烯塑料薄膜的生物降解方面具有很广泛的应用，为聚乙烯塑料的生物降解提供了新资源，具有良好的应用前景。

主设计要求

1.一株聚乙烯塑料高效降解菌株，其特征在于，聚乙烯塑料高效降解菌株RaoultellaornithinolyticaMP-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo:15724；保藏时间为：2018年5月4日。

设计方案

1.一株聚乙烯塑料高效降解菌株，其特征在于，聚乙烯塑料高效降解菌株Raoultellaornithinolytica<\/i>MP-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No: 15724；保藏时间为：2018年5月4日。

2.一种权利要求1所述的聚乙烯塑料高效降解菌株的应用，其特征在于：所述的聚乙烯降解菌株MP-1在生物降解聚乙烯中的应用。

3.按权利要求2所述的聚乙烯塑料高效降解菌株的应用，其特征在于：所述的聚乙烯降解菌株MP-1在水体中生物降解聚乙烯薄膜的应用。

设计说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种聚乙烯塑料高效降解菌及其分离筛选方法和在聚乙烯塑料生物降解方面的应用。

背景技术

塑料是由石化产品加工合成的有机化合物，由于其优良的化学稳定性和机械性能及其耐久性和经济性等特点，在生活中得到广泛应用。塑料在处置后几乎不被分解，在环境中的持续积累造成了严重的生态威胁，“白色污染”已经成为世界性难题。聚乙烯（Polyethylene，PE）是塑料制品中产量和用量最高的合成聚合物之一，其全球产量每年约为8000万吨。PE基本结构为-[CH_{2<\/sub>-CH2<\/sub>]n<\/sub>-，由于其相对分子质量较大、疏水性强，特别是高度稳定的C-C骨架及缺乏直接裂解C-C链的酶，在自然环境中生物降解性差，易在环境中积累。}

目前对废弃塑料的处置方式大多为填埋、焚烧、二次加工等，这些处理方式对环境的污染较大，处理成本高，且易造成二次污染。因此，除了研发新的环境友好的塑料制品外，对聚乙烯等塑料废弃物安全绿色处置的处理技术亟待研究开发。现如今针对聚乙烯等塑料废弃物生物治理方法研究较少，有效菌种资源不多，治理效率低，限制了其进一步的扩展应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种聚乙烯塑料高效降解菌及其分离筛选方法和在聚乙烯塑料生物降解方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一株聚乙烯塑料高效降解菌株，聚乙烯塑料高效降解菌株Raoultella<\/i>ornithinolytica<\/i> MP-1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No:15724；保藏时间为：2018年5月4日。

一种聚乙烯塑料高效降解菌株的分离筛选方法，将待分离样品通过富集培养，转接至以聚乙烯为唯一碳源的培养基中富集筛选、分离，进而获得一株能够利用聚乙烯为碳源和能源的降解菌MP-1。

所述待分离样品为环境塑料废弃物。

所述聚乙烯为唯一碳源的培养基组分为：K_{2<\/sub>HPO4<\/sub>·3H2<\/sub>O 0.7 g，KH 2<\/sub>PO4<\/sub> 0.7 g，NH 4<\/sub>NO3<\/sub> 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O 0.5 g，FeSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O 0.002 g，ZnSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O 0.002g，MnSO 4<\/sub>·H2<\/sub>O 0.001 g；将上述试剂溶解于1 L去离子水中，用1 mol\/L NaOH调节pH至7.0即为液体培养基；将上述试剂中加入1.5%的琼脂即为固体培养基。}

一种聚乙烯塑料高效降解菌株的应用，所述的聚乙烯降解菌株MP-1在生物降解聚乙烯中的应用。

所述的聚乙烯降解菌株MP-1在水体中生物降解聚乙烯薄膜的应用。

本发明涉及一种从环境塑料废弃物上分离筛选聚乙烯塑料降解菌的方法，通过富集培养，转接至以聚乙烯为唯一碳源的培养基中富集筛选，多次划线分离，分离到一株能够利用聚乙烯为碳源和能源的降解菌MP-1，该菌株的菌落形态描述特征为：菌落淡黄色，形状为圆形，表面光滑湿润、边缘整齐，轮廓清晰。革兰氏染色显红色，呈阴性。对菌株16S rRNA基因序列进行了扩增测序，将所得的序列与NCBI数据库中已有的序列进行BLAST分析，结果显示，MP-1与 Raoultella ornithinolytica<\/i>（AJ251467）的相似性为99%，且在进化距离上相对较近，结合菌株的生理生化特征，初步将MP-1鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella<\/i>ornithinolytica<\/i>MP-1）。

本申请提供的聚乙烯塑料降解菌（Raoultella ornithinolytica<\/i>），菌株名为MP-1，分离自港口漂浮的塑料废弃物表面，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No: 15724；保藏时间为：2018年5月4日，检测为存活菌株并保藏。

本发明所具有的优点：

采用本发明的塑料降解菌的分离筛选方法进而获得能够对聚乙烯降解的菌种资源，本发明获得菌株对于聚乙烯塑料生物降解方面具有很好的效果。本发明方法绿色环保，成本低，操作方便，所得菌株具有良好的降解特性，为环境中聚乙烯废弃物的生物修复提供了新资源和思路，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明提供的聚乙烯降解菌Raoultella ornithinolytica<\/i>MP-1的菌落形态特征图。

图2为本发明提供的聚乙烯降解菌MP-1的生长曲线图。

图3为本发明提供的聚乙烯降解菌MP-1的系统发育树。

图4为本发明提供的聚乙烯降解菌降解30天后PE薄膜在光学显微镜（a对照；b接菌MP-1）及扫描电镜（c对照；d接菌MP-1）的形貌特征图。

图5为本发明提供的聚乙烯降解菌降解前后PE薄膜的水接触角变化图。

图6为本发明提供的聚乙烯降解菌降解前后PE薄膜表面官能团变化图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

本发明聚乙烯PE高效降解菌Raoultella ornithinolytica<\/i> MP-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No: 15724；保藏时间为：2018年5月4日。

该菌株对塑料废弃物具有良好的降解效果，尤其是对于聚乙烯薄膜降解效果较好，该方法绿色环保，成本低，操作方便。通过采用这种生物降解的方法，处理30天后聚乙烯薄膜表面有明显的生物侵蚀孔洞，膜片亲水性显著提升，表面破损严重，处理60天后失重率可达4.37±0.66%，为聚乙烯废弃物的生物修复提供了新资源和思路，应用前景广阔。

本发明所保藏的MP-1菌株具有很强的聚乙烯降解能力，以该菌株为出发菌株在适度范围内发生突变，所获得突变株仍然具有很强的聚乙烯降解能力。

并且在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，将上述筛选获得的菌株，以及突变获得菌株单独或是任意组合，按照发酵培养方式进行扩大培养所得纯培养物或是混合培养物（将纯培养物、或混合培养物作为微生物菌剂）的形式可进一步的进行对聚乙烯PE进行降解，并且适用于大规模的实际应用，以扩大其应用范围。

实施例1

聚乙烯降解菌的分离筛选与鉴定

（1）聚乙烯降解菌的分离筛选

以从港口漂浮的塑料废弃物作为待分离样品进行分离筛选；

将采集到的塑料废弃物用无菌水冲洗后剪成小块，放置于无菌的锥形瓶中，加入0.9%的生理盐水及玻璃珠，于恒温振荡培养箱中28 ℃、180 r\/min振荡培养2 h，制备成菌悬液。将菌悬液以2%接种量（ v<\/i>\/v<\/i>）转接至无碳源矿物盐培养基中，加入已紫外灭菌的聚乙烯粉末（2 g\/L），28 ℃、180 r\/min振荡培养15 d，设置3组平行。定期取样测定体系的OD _{600<\/sub>值，培养体系变浑浊后继续转接，重复培养3次。挑选生长迅速的培养体系逐级梯度稀释制备不同稀释度（10^{-3<\/sup>、10-4<\/sup>、10-5<\/sup>、10-6<\/sup>）的菌悬液，用稀释涂布平板法分离菌株，并多次划线纯化分离到的菌株。将分离到的单菌落菌株保存后，在无碳源矿物盐固体培养基上验证对聚乙烯的利用能力。无碳源固体平板表面涂布已灭菌的聚乙烯粉末，将获得的菌株在表面划线培养，挑选生长迅速的单菌落于LB平板上培养保存。}}

分离筛选的培养基为无碳源矿物盐培养基，其组分为：K_{2<\/sub>HPO4<\/sub>·3H2<\/sub>O 0.7 g，KH 2<\/sub>PO4<\/sub>0.7 g，NH 4<\/sub>NO3<\/sub>1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O 0.5 g，FeSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O 0.002 g，ZnSO 4<\/sub>·7H2<\/sub>O0.002 g，MnSO4·H 2<\/sub>O 0.001 g。将上述试剂溶解于1 L去离子水中，用1 mol\/L NaOH调节pH至7.0。固体培养基中加入1.5%的琼脂。添加聚乙烯为唯一碳源。}

通过上述的分离与筛选工作，多次分离纯化，获得一株生长迅速的聚乙烯降解菌MP-1。该降解菌在LB平板上菌落呈淡黄色，形状为圆形，表面光滑湿润，边缘整齐（图1）。

（2）菌株的生理特征及分子生物学鉴定

对培养至对数期的上述菌体进行革兰氏染色。

用试剂盒提取上述分离获得的单一菌株的DNA，采用细菌通用引物27F、1492R作为扩增引物进行PCR扩增。

16S rDNA序列引物27F：5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3'，1492R：5'- GGTTAC CTT GTT ACG ACT T- 3'。

PCR扩增体系（50 μL）：模板DNA 5 μL，Mix(2×) 25 μL，引物27F 2 μL，引物1492R2 μL，ddH _{2<\/sub>O 16 μL。扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性1 min；58℃退火1 min；72℃延伸2 min，循环30次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。对扩增产物进行电泳检测，委托英潍捷基（北京）生物公司测序。将所得的序列与NCBI数据库中已有的序列进行BLAST分析，并选取同源性相近的菌株，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树（参见图3）。}

光学显微镜下，菌株经革兰氏染色显红色，呈阴性。MP-1在LB培养基中的生长曲线如图2所示，MP-1在LB培养基中生长迅速，2 h后开始进入对数生长期。16S rDNA序列比对结果显示，MP-1与 Raoultella ornithinolytica<\/i>（AJ251467）的相似性为99%，且在进化距离上相对较近（图3），结合菌株的生理生化特征，初步将MP-1鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica<\/i>MP-1）。

实施例2

聚乙烯降解菌对聚乙烯薄膜的降解实验按照以下步骤进行：

为评估聚乙烯降解菌在实际生活中的应用潜力，选取生活中常见的聚乙烯薄膜进行降解实验。

将MP-1按2-5%的接种量接种至LB培养基中培养至对数生长期，用0.01 mol\/L磷酸盐缓冲溶液洗涤3遍去除表面的培养基，之后再用无碳源矿物盐培养基重悬，而后调节重悬菌液OD _{600<\/sub>值为1.0。聚乙烯膜片裁剪成2×2 cm ^{2<\/sup>大小，称重后用75%的乙醇灭菌2 h，取出后在超净台中用无菌气流挥发掉表面的乙醇。锥形瓶中加入90 mL无碳源矿物盐培养基，加入表面灭菌的聚乙烯膜片（2 g\/L），以10%（ v\/v<\/i>）的接种量接种上述MP-1重悬菌液。以不接菌处理为对照组，每种处理设置3个平行样。将锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中28 ℃、180 r\/min培养，定期取样分析聚乙烯膜片表面的形貌变化、官能团变化、质量损失及疏水性变化（参见图4）。}}

聚乙烯膜片表面微观形貌变化按照如下流程处理：用无菌水冲洗表面多余的培养基，用2.5%戊二醛固定2 h，再依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水，每次15 min，再用叔丁醇置换2次，每次30 min。将处理好的样品干燥，固定喷金后在扫描电子显微镜（Hitachi S-4800 FE-SEM，日立）下观察其微观形貌特征。

聚乙烯膜片的质量变化按照下述流程处理：用2% SDS溶液振荡洗涤聚乙烯膜片4h，超声15 min，去除表面的生物膜，再用无菌水洗涤膜片3次，将洗涤后的聚乙烯膜片放置在干燥器中干燥48 h后称重。

聚乙烯的质量衰减率（%）=（聚乙烯初始质量-降解后质量）\/初始质量×100%

聚乙烯膜片表面官能团的测定采用傅里叶红外光谱仪进行测定，清洗干净的膜片自然干燥后测定。扫描波长范围600-4000 cm ^{-1<\/sup>,分辨率4 cm -1<\/sup>,扫描次数32次。}

用接触角测量仪测定接触角表征薄膜表面疏水性变化（参见图5）。

由图4可见，经过30 d的培养，在扫描电镜下观察到接菌处理的膜片与对照组相比表面粗糙，边缘出现了崩解，表面出现明显的微生物侵蚀孔洞。并且由图5可见，经接触角测量仪结果显示，接菌处理的聚乙烯膜片水接触角为74.4±0.3°，远低于对照处理93.5±2.4°，表明接菌处理显著降低了PE薄膜的疏水性，更易于被微生物附着侵蚀。同时由图6中FTIR结果显示，降解后PE薄膜出现了新的特征峰，在1716 cm ^{-1<\/sup>测到了羰基峰。羰基 [-C=O-键]（1720cm -1<\/sup>左右）的出现是PE发生生物降解的基本标志，表明聚乙烯发生了生物降解。而后继续按照上述培养方式培养至60 d后，接种MP-1处理的膜片质量降低了4.37±0.66%,而对照处理未发生变化，表明利用MP-1降解了聚乙烯。}

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

设计图