一种苏云金芽孢杆菌培养方法及其液体培养基论文和设计-汪少斌

全文摘要

本发明公开一种苏云金芽孢杆菌的液体培养基及培养发酵方法，所述液体培养基中由于添加牛磺酸而取得了显著的毒力提升；而牛磺酸和水杨酸的组合更是取得明显的协同作用，将苏云金芽孢杆菌发酵液毒力提升至对3龄小菜蛾致死率达到令人惊讶的96.7％。本发明的苏云金芽孢杆菌的液体培养基成本低、培养方法简单，稳定性较好，便于长途运输和长期保存，具有良好的推广应用前景。

主设计要求

1.一种苏云金芽孢杆菌的液体培养基，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖4-9％，尿素0.1-1％，磷酸氢二钾0.1-2％，无水乙酸钠0.1-2.5％，硫酸镁0.01-0.1％，氯化铁0.01-0.1％，牛磺酸0.1-2％，水杨酸0.1-2%，其余为无菌水。

设计方案

2.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌的液体培养基，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖5-7％，尿素0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.5-1％，无水乙酸钠1-2％，硫酸镁0.01-0.02％，氯化铁0.01-0.03％，牛磺酸0.2-1％，水杨酸0.2-1%，其余为无菌水。

3.根据权利要求2所述的苏云金芽孢杆菌的液体培养基，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌的液体培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，牛磺酸0.5％，水杨酸0.5%，其余为无菌水。

4.权利要求1-3所述培养基的配制方法，其特征在于：按照所述原料组成，精密称取各原料组分，并置于容量瓶中，然后使用无菌水定容至1L，混匀。

5.权利要求1～3任一项所述的苏云金芽胞杆菌液态培养基在培养苏云金芽胞杆菌菌种中的用途。

6.一种苏云金芽孢杆菌的培养发酵方法，其特征在于：将权利要求1-3中任一项所述培养基，每250ml三角瓶40ml装量，用氢氧化钠调培养基pH值为7.0，灭菌后，每瓶接种苏云金芽孢杆菌H14菌株3.5％；温度31℃，震荡培养72h，收集的发酵液。

设计说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物培养方法及其液体培养基，具体涉及一种苏云金杆菌液体发酵培养基。

背景技术

虫害是限制农作物稳定高产的一个重要的因素，每年被害虫侵吞的粮食占总产量的1\/4左右。长期以来，人们依靠化学农药解决虫害问题；但农药的使用非但没能很好解决虫害问题，却同时造成一系列严重的危害后果，如人畜中毒、环境污染等。因此，化学杀虫剂的应用受到环保组织和社会的巨大压力。伴随着人们环保意识的觉醒及不断增强，生物农药逐渐开始受到重视，受到越来越多的关注。生物防治具有无污染、杀虫效率高、不易产生抗性等优点，被认为是较为理想的防治手段。生物防治也越来越受到有关部门及科研机构的重视，其中令人瞩目的是利用昆虫病原细菌防治蚊虫方面的研究应用。在这其中，苏云金芽孢杆菌是世界公认的应用最为广泛及成功的微生物杀虫剂之一。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏染色阳性反应(G+)细菌，主要特性在于形成芽孢的同时在菌体内形成具有蛋白质性质的一个或多个伴胞晶体。而所述伴孢晶体对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生线虫等有较强的毒杀作用，而对非目标生物安全因此，Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点。目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种，是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂，因而倍受人们关注。Bt以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)对多种蚊虫有高效活性，已成功开发为生物杀虫剂用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆虫的防治，在疟疾、登革热、黄热病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用。然而目前生产应用的Bti菌仍存在杀虫范围窄、有效成分易降解、易受环境因素影响等缺点，还陆续有Bt在实验室条件下形成一定抗药性的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的苏云金芽孢杆菌液体培养基及其配制方法。微生物杀虫剂商业化前，培养基的选择极其重要，高效的发酵培养基能充分发挥杀虫活性菌株的毒力和致病率。本发明即提供了一种综合利用碳源、氮源和金属离子配制成的苏云金芽孢杆菌培养方法及其液体培养基，尤其是牛磺酸和水杨酸的加入，更是给苏云芽孢杆菌的杀虫效果带来了极大的提升，取得了预料不到的技术效果。本发明的培养基将苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾的毒力，从60％左右的致死率提高到95％以上，杀虫效果提升明显。

申请人在研究中发现，在苏云金芽孢杆菌液体培养基中添加牛磺酸能够极大提高发酵液对虫害(如小菜蛾)的杀伤力，而水杨酸的加入更是能够进一步协同加强这种杀伤力，制备得到的发酵液对3龄小菜蛾的致死率达到95％以上。

本发明的液体培养基由以下组分组成：葡萄糖、尿素、磷酸氢二钾、无水乙酸钠、硫酸镁、氯化铁、牛磺酸、水杨酸和无菌水。

所述液体培养基的原料配比为(w\/v)：葡萄糖4-9％，尿素0.1-1％，磷酸氢二钾0.1-2％，无水乙酸钠0.1-2.5％，硫酸镁0.01-0.1％，氯化铁0.01-0.1％，牛磺酸0.1-2％，水杨酸0.1-2％，其余为无菌水。

优选地，所述配比为(w\/v)：葡萄糖5-7％，尿素0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.5-1％，无水乙酸钠1-2％，硫酸镁0.01-0.02％，氯化铁0.01-0.03％，牛磺酸0.2-1％，水杨酸0.2-1％，其余为无菌水。

更优选地，所述配比为(w\/v)：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，牛磺酸0.5％，水杨酸0.5％，其余为无菌水。

本发明的有益效果：1、本发明的液体培养基成本低，组成简单，克服了传统的苏云金芽孢杆菌培养基成本高、不宜大规模生产、生产操作过于复杂的缺点，便于长途运输和长期保存。2、使用本发明的苏云金芽孢杆菌得到的苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾有较高的毒力，杀虫效果显著。本发明还对瓢虫、麦瘿蚊等多种昆虫均有优越的的杀虫特性；具有良好的推广应用前景。

具体实施方式

实施例1：培养基的配制

制备四组培养基，分别为对照培养基、培养基1(添加牛磺酸)、培养基2(添加水杨酸)和培养基3(添加牛磺酸和水杨酸)，其具体配比及配制方法如下(w\/v)：

对照培养基：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，其余为无菌水；其配制方法为：精密称取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g，分别加入容量瓶中，使用无菌水定容至1L，混匀。

培养基1：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，牛磺酸1％，其余为无菌水；其配制方法为：精密称取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、牛磺酸10g，分别加入容量瓶中，使用无菌水定容至1L，混匀。

培养基2：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，水杨酸1％，其余为无菌水；其配制方法为：精密称取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、水杨酸10g，分别加入容量瓶中，使用无菌水定容至1L，混匀。

培养基3：葡萄糖5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.5％，无水乙酸钠1％，硫酸镁0.01％，氯化铁0.01％，牛磺酸0.5％，水杨酸0.5％，其余为无菌水；其配制方法为：精密称取葡萄糖50g、尿素1g、磷酸氢二钾5g、无水乙酸钠10g、硫酸镁0.1g、氯化铁0.1g、牛磺酸5g、水杨酸5g，分别加入容量瓶中，使用无菌水定容至1L，混匀。

实施例2：苏云芽孢杆菌的发酵培养及毒力检测

按以上培养基配方，每组培养基设置3个250ml三角瓶，每250ml三角瓶40ml装量，用氢氧化钠调培养基pH值为7.0，高压灭菌后，每摇瓶接种苏云金芽孢杆菌H14菌株3.5％，温度为31℃，培养72h，从每瓶培养基提取5ml发酵液用无菌水稀释到100ml制成供试发酵液；使用所述供试发酵液浸泡小白菜叶片，5min后取出，晾干后加入养虫瓶中，以无菌水浸泡的叶子为空白对照，每瓶接入20条大小一致、已饥饿24h的小菜蛾3龄幼虫，23℃恒温饲养，48h后统计致死率，试验结果见表1。

表1：

如表1所示：本发明的苏云金芽孢杆菌培养发酵方法得到的苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾均有较高的毒力；其中，牛磺酸的加入能够显著提高培养的发酵液的毒力；水杨酸的加入，虽然也能够对发酵液的毒力产生一定提高，但作用有限；而牛磺酸和水杨酸的同时加入，却取得了明显的毒力提升，令苏云金芽孢杆菌发酵液对3龄小菜蛾的48h平均致死率达到96.7％(甚至达到100％)，杀虫效果卓越，取得了预料不到的技术效果。另外，本发明还对瓢虫等多种昆虫昆虫进行了杀虫效果测试，同样具有显著的杀虫效果。

设计图

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