人朊病毒蛋白G127V和G131V突变体的构象转变倾向研究

论文摘要

致死性的神经系统退行性疾病朊病毒病（Prion disease）,其致病过程与正常态的朊病毒蛋白（Cellular prion protein,PrPe）转变成瘙痒态的阮病毒蛋白（Scrapie prion protein,PrPsc）密切相关。但是,朊病毒病致病的具体分子机制尚不清楚。支持朊病毒病的“唯蛋白”假说的关键证据,在于遗传型朊病毒病与PrP编码基因（Prion protein gene,PRNP）之间的联系。有10-15%的朊病毒病与基因突变相关,目前,人PRNP 上与遗传型朊病毒病相关的突变位点共有40个左右。其中,人朊病毒蛋白（Human prion protein,HuPrP）的G131V突变体被鉴定为格斯特曼综合征（Gerstermann-Straussler-Scheinker syndrome,GSS）的致病突变体。此外,有幸的是,最新研究发现,HuPrP的G127V突变体对克雅式病（Creutzefeldt-Jakob diseases,CJD）以及库鲁病（Kuru）都具有很强的抗病能力。为揭示G131V突变体的致病机理和G127V突变体起保护作用的分子机制,本论文选取全长HuPrP（23-231）和截短的HuPrP（91-231）野生型及其单点突变体G127V和G131V,进行了纤维化和寡聚化倾向研究。实验结果表明,G127V（23-231）与WT（23-231）的纤维化和寡聚化倾向相当,G127V（91-231）的纤维化倾向远小于WT（91-231）,但寡聚化倾向却远大于WT（91-231）。G131V突变体减弱了HuPrP的纤维化倾向,增强了HuPrP的寡聚化倾向。同时,我们还发现无规卷曲片段23-90的作用比较复杂:增强了WT和G131V突变体的寡聚化倾向,却减弱了 WT和G131V突变体的纤维化倾向;增强了G127V突变体的纤维化倾向,却减弱了它的寡聚化倾向。其分子机制值得将来深入探讨。此外,我们还比较WT（23-231）、G127V（23-231）、G131V（23-231）、WT（91-231）、G127V（91-231）和G131V（91-231）这六个HuPrP的野生型和突变体的结构特征和热动力学稳定性差异。本课题组利用NMR技术解析了 G127V突变体的溶液结构,与野生型相比,G127V（91-231）的128-131和161-164片段倾向形成伸展结构（Stretch-Strands pattern,SSs）,而不能形成p-折叠片。比较G13]V（91-231）与WT（91-231）的1H-15N HSQC谱,发现谱峰移动或展宽较为明显,提示WT（91-231）与G131V（91-231）的空间结构可能差别较大。G127V和G131V突变体与野生型的结构差异,可能是影响构象转变存在差异的重要因素。此外,我们还通过盐酸胍变性和热变性实验,探究了HuPrP的野生型和G127V及G131V突变体的热动力学稳定性,发现G127V和G131V点突变对HuPrP稳定性没有明显影响,而且片段23-90对HuPrP的稳定性的影响也较小。我们据此猜想,朊病毒蛋白的热动力学稳定性与构象转变倾向基本不相关或并非简单相关。本论文的研究结果为深入理解PrP构象转变和PrP致病机理奠定了基础,也为防治朊病毒病、研发抗朊病毒病药物提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 绪论
•   1.1 阮病毒病与朊病毒蛋白
•     1.1.1 朊病毒病的研究史
•     1.1.2 朊病毒蛋白的生物学特征
•     1.1.3 朊病毒蛋白的错误折叠
•     1.1.4 朊病毒病与基因突变
•   1.2 朊病毒蛋白野生型与突变体的纤维化
•     1.2.1 淀粉样纤维的形成机制
•     1.2.2 朊病毒蛋白纤维化的影响因素
•     1.2.3 蛋白质淀粉样纤维的检测技术
•     1.2.4 朊病毒蛋白纤维化的研究现状
•   1.3 朊病毒蛋白野生型与突变体的寡聚化
•     1.3.1 朊病毒蛋白寡聚体的神经毒性
•     1.3.2 朊病毒蛋白寡聚化的影响因素
•     1.3.3 朊病毒蛋白寡聚化的研究现状
•   1.4 朊病毒蛋白野生型与突变体的结构研究
•   1.5 朊病毒蛋白野生型与突变体的稳定性
•   1.6 本论文的研究目的与科学意义
• 第二章 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体的表达纯化
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株和载体
•     2.2.2 主要药品和耗材
•     2.2.3 主要仪器设备
•     2.2.4 主要试剂的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 G127V和G131V突变体的构建
•       2.3.1.1 引物设计
•       2.3.1.2 定点突变PCR
•       2.3.1.3 PCR产物纯化
•     2.3.2 质粒抽提与转化
•       2.3.2.1 感受态细胞的制备
•       2.3.2.2 重组质粒转化至感受态细胞
•     2.3.3 蛋白的表达纯化
•       2.3.3.1 突变体蛋白的小量表达及测序
•       2.3.3.2 蛋白的纯化
•       2.3.3.3 蛋白质纯度检测及定量
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 HuPrP的定点突变与小量表达
•     2.4.2 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体的表达纯化
•   2.5 本章小结
• 第三章 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体的纤维化和寡聚化倾向研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 主要药品和耗材
•     3.2.2 主要仪器设备
•     3.2.3 主要试剂的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体的纤维化倾向研究
•       3.3.1.1 纤维化滞后时间的测定
•       3.3.1.2 淀粉样纤维形态的表征
•     3.3.2 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体的寡聚化倾向研究
•       3.3.2.1 寡聚化倾向的比较
•       3.3.2.2 寡聚化过程二级结构的测定
•       3.3.2.3 单体和寡聚体粒径的表征
•   3.4 实验结果与讨论
•     3.4.1 HuPrP野生型及G127V和G127V突变体纤维化滞后时间的比较
•     3.4.2 HuPrP野生型及G127V和G127V突变体淀粉样纤维形态的表征
•     3.4.3 HuPrP野生型及G127V和G131V突变体寡聚化倾向的比较
•     3.4.4 HuPrP的野生型及G127V和G131V突变体的单体和寡聚体理化性质表征
•     3.4.5 片段23-90对纤维化和寡聚化的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 G127V和G131V点突变对HuPrP结构和热动力学稳定性的影响
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 主要药品和耗材
•     4.2.2 主要仪器设备
•     4.2.3 主要试剂的配制
•   4.3 实验方法
• 15N HuPrP同位素标记样品的制备'>    4.3.1¹⁵N HuPrP同位素标记样品的制备
• 1H-¹⁵N HSQC谱的采集'>    4.3.2¹H-¹⁵N HSQC谱的采集
•     4.3.3 盐酸胍变性实验
•     4.3.4 热变性实验
•   4.4 实验结果和讨论
•     4.4.1 G127V和G131V点突变对HuPrP结构的影响
•     4.4.2 G127V和G131V点突变对HuPrP热动力学稳定性的影响
•     4.4.3 片段23-90对HuPrP热动力学稳定性的影响
•   4.5 本章小结
• 第五章 全文总结与展望
• 参考文献
• 附录 PRNP突变序列比对
• 在读期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张梅兰

导师: 林东海

关键词: 人朊病毒蛋白,突变体,纤维化,寡聚化

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R373

总页数: 99

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