导读:本文包含了表面展示论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:表面,芽孢,酵母,细胞,病毒,免疫,杆菌。
表面展示论文文献综述
贺文斌,徐黎明,赵景壮,刘淼,任广明[1]（2019）在《传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立》一文中研究指出为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显着性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。(本文来源于《大连海洋大学学报》期刊2019年05期）
林婧楠,赵景壮,刘淼,任广明,卢彤岩[2]（2019）在《鲤春病毒血症病毒糖蛋白酵母表面展示系统的建立》一文中研究指出糖蛋白(Glycoprotein, G)作为鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus, SVCV)主要的抗原蛋白,已成为现阶段SVCV病毒检测、抗体制备以及疫苗研制的热点。为了对其进行酵母表面展示,研究以SVCVshlj1分离株基因组为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段,将其克隆至酵母表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母EBY100感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子(命名为EBY100-pYD1-G),对其进行2%半乳糖诱导。利用细胞免疫荧光和流式细胞仪检测G蛋白的酵母表面展示情况。细胞免疫荧光结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞所占比例不断增加,各组之间差异显着(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比,其中诱导48h与72h的酵母细胞荧光强度不存在显着差异,基本趋于稳定不变的状态。因此,选取诱导48h为酵母表面展示的最佳诱导时间。上述研究结果表明SVCV的G蛋白已经成功展示于酿酒酵母细胞表面,研究为鲤春病毒血症酵母口服疫苗的研发奠定了前期基础。(本文来源于《水生生物学报》期刊2019年05期）
蒋晓敏[3]（2019）在《耐热β-半乳糖苷酶在枯草杆菌芽孢表面的展示及酶学性质研究》一文中研究指出β-半乳糖苷酶是一种在食品工业中有着广泛应用的酶制剂。近年来,有关β-半乳糖苷酶的应用开发主要受制于稳定性低、有机溶剂耐受性差、重复利用率低等因素,这些因素限制了β-半乳糖苷酶在食品工业的进一步应用。β-半乳糖苷酶枯草杆菌芽孢表面展示技术是一种将β-半乳糖苷酶固定化于芽孢表层蛋白的一种固定化技术,由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性,使得芽孢可以成为一个优良的固定化载体。但是,展示在芽孢上的β-半乳糖苷酶酶活性较低一直制约着该生物催化剂的发展。本研究采取叁种不同类型的展示机制将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶展示在枯草杆菌芽孢表面,然后对这叁者的展示效率以及酶学特性进行分析,优化芽孢展示机制,筛选出最适用于食品工业的生物酶制剂。首先,选用不同嗜温微生物来源的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型黏附模块(cohesin)与对接模块(dockerin),成功构建5种基于脚手架骨架(cohesin-dockerin)相互作用原理的β-Gal芽孢表面展示体系:β-Gal-DocⅠ-1/CotG-CohⅠ-1、β-Gal-DocⅠ-2/CotG-CohⅠ-2、β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3、β-Gal-DocⅡ-1/CotG-CohⅡ-1、β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1,其酶活分别为1.9、1.86、1.97、1.71、1.64 U/mg芽孢(干重)。而β-Gal与锚定蛋白直接融合表达展示系统CotG-β-Gal和基于P_(cry1Aa)启动子表达的无锚定蛋白的β-Gal芽孢表面展示系统P_(cry1Aa)-β-Gal的酶活则分别为1.83U/mg和2.48 U/mg芽孢(干重)。免疫荧光显微镜和Western blot分析证实上述β-Gal芽孢表面展示系统均构建成功。其次,选取酶活相对较高的β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和较低的β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1、CotG-β-Gal、P_(cry1Aa)-β-Gal这叁种基于不同展示机制构建的β-Gal芽孢表面展示体系,利用Dot blotting测定每组芽孢表面固定的β-Gal分子数,P_(cry1Aa)-β-Gal单个芽孢表面展示β-Gal分子数达1.3×10~5,CotG-β-Gal为4.3×10~4,β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1分别为3.0×10~4和2.8×10~4。对比各组酶活和蛋白表达量的差异,结果表明基于cohesin-dockerin相互作用原理的β-Gal芽孢表面展示系统的β-Gal展示效率对啊,最高,CotG-β-Gal次之,P_(cry1Aa)-β-Gal最低。最后,考察重组芽孢β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3、β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1、CotG-β-Gal、P_(cry1Aa)-β-Gal以及游离的β-Gal(从无锚定蛋白芽孢表面展示系统中解离得到)的酶学特性。不同芽孢表面展示体系中β-Gal的最适pH均为6.0,最适温度均为75℃;在热稳定性和有机溶剂耐受性方面,CotG-β-Gal>β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3,β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1>P_(cry1Aa)-β-Gal;在循环使用6次后,各类重组芽孢酶活并没有丧失太多,残余酶活均保持在60%左右;β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1的K_m值分别为3.83 mM和3.71 mM,CotG-β-Gal为4.43mM,P_(cry1Aa)-β-Gal为5.71 mM。综上所述,相比于β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1和P_(cry1Aa)-β-Gal二者,直接融合展示型CotG-β-Gal和基于优化的脚手架蛋白展示型β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3有着较高的酶活和优良的酶学特性,十分适用于食品工业催化领域。(本文来源于《浙江农林大学》期刊2019-06-20）
刘欢欢,李树东,杨雨晴,孙晓莹,李岩[4]（2019）在《表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重组干酪乳杆菌的构建及其免疫原性》一文中研究指出本研究旨在构建重组干酪乳杆菌pLA-Newcastlediseasevirus (NDV)-F/Lactobacillus casei,获得表达产物,并探讨其免疫效果。利用PCR扩增携带部分主要抗原表位的NDV F基因,与穿梭质粒pLA连接转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,筛选阳性重组质粒,将其电转化至干酪乳杆菌中,构建重组干酪乳杆菌pLA-NDV-F/L. casei,应用PCR鉴定阳性菌株,Western blotting鉴定重组菌反应原性,间接免疫荧光、流式细胞术和激光共聚焦检测蛋白表达情况。试验选用14日龄雏鸡,各组免疫方式为口服+滴鼻。设立pLA-NDV-F/L. casei两次免疫组和叁次免疫组、弱毒疫苗组、 pLA/L.casei、未攻毒PBS组和攻毒PBS组。间接ELISA方法检测雏鸡血清IgG、肠道、鼻腔、肺脏中sIgA抗体效价,评价试验组雏鸡攻毒保护率。结果表明,有94.10%的重组菌表达了F蛋白,且高效表达在干酪乳杆菌细胞表面,蛋白大小为62kDa,并能与抗NDV阳性血清特异性结合。各免疫组anti-F IgG和s Ig A抗体水平显着高于对照组,p LA-NDV-F/L. casei叁次免疫组抗体持续时间比两次免疫组延长28 d,抗体峰值没有显着差异。免疫pLA-NDV-F/L. casei叁次、两次、弱毒疫苗、pLA/L. casei和PBS的攻击保护率分别为80%、80%、90%、0%和0%。因此,利用干酪乳杆菌表达体系成功表达了携带部分抗原表位的NDVF基因,具备良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫应答。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年08期）
郭佳,蒋韵,滕飞,尹衍新,于丽华[5]（2019）在《间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体重链CDR3随机突变哺乳动物细胞表面展示文库的构建》一文中研究指出目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体3E1D7的重链补体决定区3(CDR3)随机突变抗体库。方法用定向进化的方法在嵌合抗体3E1D7重链CDR3内部造成基因随机突变,将其通过双酶切克隆到哺乳动物细胞展示载体pSZI-CD中构建随机突变抗体库。抗体库基因转染CHO细胞,流式细胞术检测抗体基因是否在细胞表面表达。结果 3E1D7重链CDR3随机突变抗体库构建成功,库容量达到5.52×10~6。随机挑选20个阳性克隆进行测序鉴定, 20个克隆均在不同位置发生碱基突变且没有重复突变,编码20种不同的氨基酸序列,抗体库具有较好的多样性和随机性。流式细胞术分析抗体基因库上膜情况,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达。结论通过哺乳动物细胞表面展示技术,成功构建了库容量达到5.52×10~6的c-Met嵌合抗体重链CDR3随机突变抗体库。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2019年06期）
杨少杰[6]（2019）在《芽孢表面展示海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建及应用》一文中研究指出表面展示是将异源多肽和蛋白质固定在噬菌体、细胞或芽孢表面的一种分子生物学技术,而目前已经完成了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的全基因组测序,并且它具有食品安全性,其产生的芽孢也具有极高的安全性,更方便于构建芽孢表面展示系统。海藻糖具有在极端环境下保护生物大分子生命体特征的生物学功能,目前,已实现海藻糖规模化生产的方法为酶法,包括双酶法和单酶法。单酶法是在海藻糖合酶(TreS)作用下,直接将麦芽糖异构为海藻糖的方法。该方法过程简单,易于操作,引起了各国科学家的重视。针对上述内容,本文开展了以下研究工作:(1)选取了11种芽孢衣壳蛋白分别将EGFP展示在B.subtilis WB800n芽孢表面。通过Western Blot及免疫荧光分析,证明已成功将EGFP分别展示在11株重组菌的重组芽孢表面,并得到了不同衣壳蛋白所展示EGFP荧光强度大小的关系为:CotX>CotY>CotF>CotC>CotE>CotG>CotV>CotB>CotM>CotA>CotW。(2)根据测得的不同芽孢衣壳蛋白所展示绿色荧光强度的大小,分别选取了芽孢锚定蛋白CotX、CotY、CotF、CotC、CotE和CotG作为分子载体,构建了芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组枯草芽孢杆菌。通过Western Blot及酶活性分析,证明已成功将海藻糖合酶TreS展示到B.subtilis WB800n芽孢表面,测得6株重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活分别为3687.64 U/g(cotX),1791.16 U/g(cotY),862.18 U/g(cotF),886.11 U/g(cotC),621.96 U/g(cotE),484.51 U/g(cotG),与所测得的所展示绿色荧光强度大小的关系基本一致。(3)利用芽孢衣壳蛋白CotC和CotG同时作为分子载体,构建了在芽孢表面共展示TreS的重组枯草芽孢杆菌,通过激光共聚焦显微镜、Western Blot及酶活分析,证明已成功将TreS共展示到B.subtilis WB800n芽孢表面。TB培养基摇瓶发酵96 h后,测定共展示TreS的重组菌单位菌体干重芽孢表面展示的酶活为1511.6 U/g。利用Dot Blot分析,测得CotC和CotG蛋白分别和共同展示TreS时,单个芽孢所展示的TreS分子数分别为2.84×10~9(CotC)、1.38×10~9(CotG)和4.65×10~9(CotC+CotG)个。通过对TB培养基的优化,发酵总菌体数为1.66×10~9 cfu/mL,芽孢数为1.50×10~9cfu/mL,产芽孢率达90.36%,共展示TreS重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活达2450 U/g。(4)敲除了芽孢萌发基因sleB和cwlJ,有效控制了表面展示TreS重组芽孢在转化体系中的萌发。通过对重组菌B.subtilis WB800n(△sleB,△cwlJ)/cotC-treS-cotG-treS的重组芽孢在不同条件下对麦芽糖的转化,证明其芽孢表面展示的海藻糖合酶TreS具有良好的热稳定性及pH耐受性,并且其芽孢在循环转化四次后仍能维持较高酶活。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2019-06-04）
王利武[7]（2019）在《枯草芽孢杆菌芽孢表面展示黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的研究》一文中研究指出农药与人们的生活息息相关。为保证农作物的产量,人们在田地中大量施放农药,造成土壤中农药累积,可能会威胁环境和食品安全。有机磷类农药是使用量最多的农药之一,会造成慢性中毒(如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等)。在2010年至2018年之间,已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件。国家标准规定的气相色谱检测方法需要昂贵仪器,不适用于日常快速现场检测。机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,酶抑制法是根据AChE活性受到抑制程度来测定有机磷农药残留量的方法。具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点,适合水果蔬菜有机磷农药残留量的检测。目前,AChE主要从昆虫或动物血液中提取,产量低、成本高、酶活性不稳定,严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。本论文获得黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶(DmAChE)。将其基因连接到pHT43质粒中并实现大肠杆菌内复制扩增并提取,再将提取的质粒转入到枯草芽孢杆菌WB800N中获得重组菌株pHT43-ache-WB800N,经IPTG诱导表达DmAChE,并通过western blot检测成功表达DmAChE。酶学性质研究表明,DmAChE酶活力为53U/mg,Km值为0.058mmol/L;最适酶反应温度为30℃,最适pH值为7。在上述工作基础上,我们以芽孢表面展示技术实现了DmAChE的固定化,提高了该酶的环境耐受性。将黑腹果蝇的乙酰胆碱酯酶基因与六种芽孢衣壳蛋白(CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ)共同连接到pHT43载体上,将其转化入枯草芽孢杆菌WB800N中并实现孢子化,通过观察不同孢子表面免疫荧光差异,确定最佳的锚定蛋白为CotG。酶学性质研究表明,其酶活性为0.7U/mg,然后检测了G-AChE在20-70℃温度下及pH=4.0-9.0的条件下的相对酶活性,发现其在70℃条件下仍能保存60%以上的相对酶活性,且对酸碱的耐受性也大大增加,在pH为4的条件下,相对酶活性依然能够达到60%以上,远高于DmAChE温度耐受性和酸碱耐受性。综上所述,枯草杆菌芽孢表面展示系统作为一种新型的抗逆性酶固定化技术,可以很好地解决目前酶抑制法检测有机磷农药时AChE酶活性不稳定的问题,希望通过后续研究可以研制出能够稳定检测有机磷农药的快速检测商品。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
牟颖丽[8]（2019）在《嗜热链球菌β—半乳糖苷酶的转糖基活性研究及表面展示系统的建立》一文中研究指出嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是一类重要的食品安全级菌株,常用于酸奶或奶酪等乳制品的生产。嗜热链球菌利用胞内的β-半乳糖苷酶将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,前者通过糖酵解途径转化成乳酸,而后者不能被消耗并全部泵到细胞外,导致乳制品中残留了大量的半乳糖和部分未被利用的乳糖,不利于人类健康。除此之外,β-半乳糖苷酶还能够发挥转糖基活性生成低聚半乳糖(GOS),减少发酵乳中半乳糖的残留。因此,调节其分解活性与转糖基活性有助于生产低糖健康的乳制品,然而对其转糖基活性的相关位点少有报道,限制了其在食品工业的应用。近年来,由于细胞固定化酶有更好的催化活性和稳定性,乳酸菌表面展示系统得到迅速发展,而关于嗜热链球菌表面展示系统的报道较少。本文主要利用生物信息学分析对S.thermophilus&SDMCC050237的β-半乳糖苷酶进行理性改造,从而提高其转糖基活性,同时鉴定并研究了嗜热链球菌的烯醇化酶的表面锚定功能及用于表面展示的潜力。具体的实验结果如下:1.嗜热链球菌中高活性p-半乳糖苷酶的筛选β-半乳糖苷酶对嗜热链球菌的食品工业应用有重要意义。本文使用X-Gal平板检测了嗜热链球菌产β-半乳糖苷酶的能力并以oNPG为底物检测了酶活,发现不同菌株的β-半乳糖苷酶之间存在活性差异。将活性较高的细胞破碎液与乳糖溶液混合反应后利用TLC法初步分析了反应液中糖的成分,结果表明,不同菌株的β-半乳糖苷酶在自然条件下转糖基活性较弱且无明显差距,导致其发酵液中残留了较多的半乳糖。2.β 半乳糖苷酶BgaQ的酶学性质研究及其转糖基活性条件的优化以 S.thermophilus SDMCC050237为材料,克隆其β-半乳糖苷酶基因bgaQ,使用表达质粒pET28a(+)在E.coli DE3中过表达BgaQ蛋白。镍柱亲和层析纯化后获得目标蛋白(113 kDa)。以oNPG和乳糖为底物时BgaQ的酶活分别为4725.3±155.4 U/mg和88.3±1.4U/mg。酶学性质表明,BgaQ的最适温度为50℃,温度耐受范围为37℃～60℃,高温下稳定性下降;最适pH为8.5,pH值稳定性较高。另外,Na-、K-、Mg2-、Ba2+和Co2+促进酶活,而Fe2+、Ni2-和Co2+抑制酶活,该酶对Zn2-和Cu2-不耐受。转糖基活性的条件优化结果表明,该酶生成GOS的最优乳糖浓度为25%,最优温度为50℃,最优pH为6.5。优化后的反应条件为15%的乳糖浓度,pH=6.5,50℃条件下反应5 h,GOS的转化率为45.0±3.4%。3.定点突变提高β-半乳糖苷酶的转糖基活性嗜热链球菌的β-半乳糖苷酶具有分解活性和转糖基活性,其工业应用具有重要意义和广阔前景。为了提高嗜热链球菌β-半乳糖苷酶的转糖基活性,本文对筛选出的β-半乳糖苷酶BgaQ进行同源建模,通过序列迭合找到了两个谷氨酸活性位点,以β-3'-galactosyl-lactose为底物进行Autodocking分析,获得转糖基活性相关位点并通过序列比对分析成功构建了Y801H/P802G突变体蛋白mBgaQ。以oNPG和乳糖为底物测得mBgaQ的酶活力分别为5957.7±209.1 U/mg和81.9±3.6 U/mg,以乳糖为底物时mBgaQ的酶活力基本与野生型相同。酶学性质表明,mBgaQ的最适温度为50℃,在37℃～45℃能发挥活性,对高温的耐受性显着下降;最适pH为8.5,在酸性和中性环境下稳定性较好,在碱性环境下稳定性下降。Na+、K+和Mg2+促进酶活,Zn2+、Ni2++、Mn2+和Co2+抑制酶活,且该酶对Cu2+不耐受。转糖基优化结果显示,mBgaQ生成GOS的最佳乳糖浓度为25%,最佳pH为6.5,最佳反应温度为42℃。优化后的反应条件为:115%乳糖浓度、pH=6.5、50℃下反应5h,最终生成GOS的转化率为58.3±1.4%,与野生型相比提高了 13%。另外,本文检测了低乳糖浓度时mBgaQ与BgaQ生成GOS量以及残留半乳糖量的时间曲线,发现mBgaQ生成GOS的转化率最高为26.7±0.5%,比BgaQ提高了6%,其残留的半乳糖量也低于BgaQ。4.基于烯醉化酶建立嗜热链球菌的表面展示系统烯醇化酶是糖酵解途径的关键酶,不仅能在胞质内发挥活性,还能分泌到细胞表面,是一种间歇蛋白(moonlighting protein)。本文从Sthermophilus CGMCC7.1 79的基因组中找出烯醇化酶编码基因eno M,将EnoM蛋白序列与致病性链球菌的烯醇化酶蛋白序列进行了比对分析,发现具有高度同源性,这表明其烯醇化酶具有表面展示的潜能。随后我们用pET28a(+)质粒分别将GFP蛋白和GFP-EnoM融合蛋白在E.coli DE3中过表达并纯化,结合反应结果显示,与GFP-EnoM融合蛋白孵育的菌体细胞荧光强度显着提高,说明EnoM将GFP蛋白锚定在细胞表面。为了探索EnoM的锚定原理,用不同化学试剂处理菌体细胞,发现经过SDS处理的细胞基本检测不到荧光,表明EnoM与细胞表面的蛋白质结合。对EnoM在乳酸菌中的适用性进行探究,发现其在其它乳酸菌中也具有表面锚定功能。为了进一步证实EnoM的表面展示功能,将分子量较大的β-半乳糖苷酶mBgaQ展示到嗜热链球菌的表面并保持了酶的活性,固定化酶在反复利用8次后仍然维持64%的酶活。为了验证EnoM能否在嗜热链球菌中实现靶向表达,构建了S.thermophilus CGMCC7.179/pLEISS-D2-gfp-enoM重组菌株,提取其胞内蛋白和表面蛋白进行Western Blot检测,发现GFP-EnoM蛋白成功表达但是没有锚定到细胞表面,可能与分泌量不足或者嗜热链球菌致病性的缺失有关。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-24）
徐小清,刘定康,夏武成,刘子璐,江正兵[9]（2019）在《纤维素酶在酿酒酵母中的表面展示》一文中研究指出利用木质纤维素进行生物法生产燃料乙醇在解决世界能源危机上有十分广阔的前景,但该产业受到预处理的限制,因此以酿酒酵母表面展示技术为依托,构建纤维素酶全细胞酶,既能水解木质纤维素又能利用水解木质纤维素得到的糖类发酵生产乙醇.将编码絮凝素锚定蛋白基因flo1与纤维酶基因cbh2串联整合在同一个开放阅读框中并构建p HBM368-PGK-flo1-cbh2重组表达载体.线性化重组表达载体后再导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSc细胞,经由功能筛选及流式细胞法验证纤维素酶成功地展示表达在酿酒细胞表面.通过DNS法测得该全细胞酶在50℃反应1 h酶活为66. 75 U/mL.成功构建了以酿酒酵母为宿主菌的全细胞酶,为后期全细胞酶协同降解秸秆等系列研究奠定基础.(本文来源于《湖北大学学报(自然科学版)》期刊2019年03期）
张阳[10]（2019）在《酿酒酵母高效表面展示β-葡萄糖苷酶提高葡萄酒香气的研究》一文中研究指出葡萄酒中的萜类物质大多以结合态糖苷的形式存在,不易释放。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)在糖苷水解过程中至关重要,然而在葡萄酒酿造过程中,其活性往往受葡萄酒发酵环境,即高浓度葡萄糖、乙醇及低pH等因素的影响,并且商业酶制剂的稳定性差、固定化酶的生产成本高等不利因素限制了BGL在葡萄酒酿造过程中的使用。近年来,酿酒酵母表面展示技术作为全细胞生物催化被认为是最有前景的方法之一,将酶展示到细胞表面,不仅可使其在活性和稳定性方面显着高于游离酶,而且具有不消耗固定化材料以及可重复利用等特点,为BGL在提升葡萄酒香气方面的应用提供了新的解决思路。本论文将来源于黑曲霉的BGL展示在酿酒酵母细胞表面,通过优化载体、启动子、锚定蛋白以及转录融合伴侣(translational fusion partner,TFP)等策略实现BGL的高效稳定展示,同时探索了酿酒酵母表面展示BGL的酶学特性及其在发酵环境下对香气糖苷的水解能力。主要研究内容及结果如下:(1)以绿色荧光蛋白(GFP)为靶蛋白,Sag1p、Sed1p、Cwp2p为锚定蛋白,利用无缝克隆技术将其插入到包含诱导型启动子GAL1的高拷贝载体pYES2/CT/α-Factor中,通过激光共聚焦显微镜观察GFP的位置。结果发现阳性对照菌株PBy-eG表达的GFP存在于细胞质中,而实验组菌株PBy-eGSA、PBy-eGSE、PBy-eGCW所表达的GFP具有向外分泌的趋势,同时在细胞周围也不存在游离形式的GFP,表明了酿酒酵母表面展示平台搭建成功。(2)分别将已构建的叁种绿色荧光蛋白锚定载体上的启动子GAL1更换为GPD和SED1的启动子,绿色荧光蛋白基因(eGFP)替换为BGL基因(bgl1),成功构建出表面展示BGL的高拷贝质粒,并将其电转入宿主菌BY4741中进行表达。结果发现;六株重组菌所展示的酶活均随培养时间的延长而降低,其中GPD启动子驱动的阳性重组菌所展示的酶活均高于SED1启动子的;叁种锚定蛋白(Sag1p、Sed1p、Cwp2p)中Sag1p表现最好;因此携带质粒GPD-HQM-Sag1的重组菌PBy-GBSa能够更为高效地展示BGL,且当培养到24 h,酶活达到最大值18.29±1.05 U/g。(3)构建了以HIS3为重组臂,URA3为筛选标记的酵母整合型载体Yip-loxp-URA3,分别将已构建的六种表面展示BGL表达盒插入到整合型载体中,成功构建了表面展示BGL的整合型质粒,通过实时定量PCR(Real time PCR)和酶活测定监测BGL在整个发酵过程中的转录水平和蛋白表达水平。结果发现,SED1启动子的转录水平要高于GPD启动子的;在蛋白表达水平,六株重组菌所展示的酶活均随培养时间的延长而逐渐升高,当培养至84 h时,酶活达到最大值;以GPD启动子驱动的阳性重组菌所展示的酶活高于SED1启动子的,且sed1p作为锚定蛋白时,所展示的BGL活性达到最高(25.22±0.81 U/g)。(4)将已构建的表面展示BGL酶活最高的阳性重组菌BY-GSE所用质粒Yip-GPD-BGL-Sed1中的MFalpha1 TFP替换为来源于酿酒酵母的23个不同的TFPs,考察TFPs对表面展示BGL活性的影响。结果显示,所有的TFPs都可以使BGL成功地展示在酵母表面,其中13-HSP150、17-SED1(195 aa)、23-CCW14和24-SED1(170 aa)的菌株所展示的BGL活性高于原始菌BY-GSE,且17-SED1(195 aa)重组菌展示的酶活最高(74.58±5.88 U/g)。(5)以商业酶制剂AR2000作为对照,考察了表面展示的BGL在不同条件下(葡萄糖、pH和乙醇)的稳定性及其在模拟葡萄汁发酵过程中对香气糖苷的水解能力。结果显示,当葡萄糖浓度低于5%时,游离态酶的活性被完全抑制,而表面展示BGL酶活的受抑制程度明显减弱,保留了12%左右的残留活性;在pH 3.0时,表面展示BGL的残留活性在50%左右,而游离态酶仅有15%左右,高出3倍以上;乙醇对表面展示BGL和商业酶制剂AR2000都具有抑制作用,且抑制趋势相似,在20%(v/v)乙醇浓度下,均保留了50%以上的残留活性;利用酵母细胞表面展示BGL所释放的萜烯醇浓度是商业酶制剂AR2000(37.58±1.16μg/L)的2.1倍。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
表面展示论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
糖蛋白(Glycoprotein, G)作为鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus, SVCV)主要的抗原蛋白,已成为现阶段SVCV病毒检测、抗体制备以及疫苗研制的热点。为了对其进行酵母表面展示,研究以SVCVshlj1分离株基因组为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段,将其克隆至酵母表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母EBY100感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子(命名为EBY100-pYD1-G),对其进行2%半乳糖诱导。利用细胞免疫荧光和流式细胞仪检测G蛋白的酵母表面展示情况。细胞免疫荧光结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞所占比例不断增加,各组之间差异显着(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比,其中诱导48h与72h的酵母细胞荧光强度不存在显着差异,基本趋于稳定不变的状态。因此,选取诱导48h为酵母表面展示的最佳诱导时间。上述研究结果表明SVCV的G蛋白已经成功展示于酿酒酵母细胞表面,研究为鲤春病毒血症酵母口服疫苗的研发奠定了前期基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
表面展示论文参考文献
[1].贺文斌,徐黎明,赵景壮,刘淼,任广明.传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立[J].大连海洋大学学报.2019
[2].林婧楠,赵景壮,刘淼,任广明,卢彤岩.鲤春病毒血症病毒糖蛋白酵母表面展示系统的建立[J].水生生物学报.2019
[3].蒋晓敏.耐热β-半乳糖苷酶在枯草杆菌芽孢表面的展示及酶学性质研究[D].浙江农林大学.2019
[4].刘欢欢,李树东,杨雨晴,孙晓莹,李岩.表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重组干酪乳杆菌的构建及其免疫原性[J].生物工程学报.2019
[5].郭佳,蒋韵,滕飞,尹衍新,于丽华.间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体重链CDR3随机突变哺乳动物细胞表面展示文库的构建[J].细胞与分子免疫学杂志.2019
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[9].徐小清,刘定康,夏武成,刘子璐,江正兵.纤维素酶在酿酒酵母中的表面展示[J].湖北大学学报(自然科学版).2019
[10].张阳.酿酒酵母高效表面展示β-葡萄糖苷酶提高葡萄酒香气的研究[D].西北农林科技大学.2019
论文知识图
