东北虎源细小病毒间接ELISA方法的建立及FPV对凋亡通路的影响

论文摘要

东北虎源细小病毒是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleucopenia virus,FPV）引起的一种急性和致死性极高的传染病。又称猫泛白细胞减少症、猫瘟热病毒、猫细小病毒、猫传染性肠炎病毒。在自然条件下,可感染熊、虎、水貂、豹等多种食肉类动物,该病发病过程急、患病过程短、传染性和死亡率较高。FPV的爆发在很大程度上对特种经济动物以及野生动物造成威胁,因此控制FPV在我国的流行、诊断和预防具有重要的意义本研究以黑龙江省某虎林园的东北虎粪便为研究对象,该虎具有出血性肠炎,精神萎靡等症状。通过病毒分离鉴定、动物回归试验及分子生物学检测等方法,证明东北虎的发病原是东北虎源细小病毒,命名为FPV-HER-NEFU。细小病毒NS1蛋白在病毒的复制和转录过程中起重要作用。研究NS1基因对细小病毒的生物学特性及诊断预防等方面研究具有指导意义。本研究对分离的东北虎源细小病毒NS1全长基因进行克隆,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析和构建分子遗传进化树。成功扩增2007bp靶基因并连接到表达载体pGEX-6P-1中以构建重组表达载体pGEX-FPV-NS1。将阳性重组质粒转化到大肠杆菌感受态Rosetta（DE3）中并用IPTG诱导。获得的可溶性蛋白质为102.6kDa,具有良好的免疫原性。我们使用该重组蛋白作为诊断抗原,建立细小病毒的间接ELISA检测方法。通过方针滴定法确定最佳条件,包括250ng/孔的抗原浓度,1:100的血清稀释度和5%脱脂乳作为封闭液,二抗浓度为1:8000,底物作用时间为25分钟。实验结果表明,建立的间接ELISA方法具有较高的特异性和灵敏度。最后,采用 TdT-mediateddUTP Nick-End Labeling（Tunel）荧光染色,DNA 片段化分析,实时荧光定量,Western Blot等方法初步探究FPV对F81细胞凋亡的影响。结果表明FPV感染F81细胞后,细胞的凋亡率随着病毒感染时间的延长而逐渐升高;FPV感染F81细胞能够显著激活细胞内Caspase-9及Caspase-3,而Caspase-8,Fas和FasL的表达无显著变化,该病毒可能通过Caspase-9/-3级联活化来诱导F81细胞发生凋亡,并且FPV感染能够上调细胞内促凋亡分子Bax的表达,下调细胞内的抑凋亡分子Bcl-2的表达。综上所述,本研究成功从东北虎粪便中分离出一株细小病毒FPV-HER-NEFU毒株,通过克隆测序获得了其主要ORF序列并进行生物信息学分析;并以表达的pGEX-FPV-NS1蛋白为抗原,建立了猫科血清抗体的间接ELISA检测方法。本研究将有助于分析我国虎源细小病毒的分子流行情况和遗传规律,为筛选虎源细小病毒疫苗株及其诊断奠定基础。并初步探究FPV对F81细胞凋亡的影响,为进一步研究FPV感染对宿主细胞的致病机制提供理论依据,同时也为其它病毒的研究提供新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 细小病毒科概述
•     1.1.1 细小病毒结构形态与理化性质
•     1.1.2 细小病毒的培养特性及基因组结构
•   1.2 FPV的研究进展
•   1.3 FPV编码蛋白
•   1.4 流行病学情况
•   1.5 FPV的诊断研究
•     1.5.1 电镜与免疫电镜观察
•     1.5.2 病毒的分离与鉴定
•     1.5.3 血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验
•     1.5.4 聚合酶链式反应（PCR）
•   1.6 细胞凋亡的研究进展
•     1.6.1 细胞凋亡的概述
•     1.6.2 病毒感染与细胞凋亡的关系
•   1.7 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 病料的来源
•     2.1.2 实验动物及细胞株
•     2.1.3 主要试验试剂及抗体
•     2.1.4 主要试验仪器
•   2.2 东北虎源细小病毒的分离鉴定
•     2.2.1 对粪便样品进行PCR鉴定
•     2.2.2 病毒的分离培养
•     2.2.3 病毒毒力的检测
•     2.2.4 病毒理化性质的测定
•     2.2.5 血凝试验
•     2.2.6 病毒PCR检测
•     2.2.7 动物回归实验
•   2.3 东北虎源细胞病毒主要ORF的克隆
•     2.3.1 主要ORF的克隆
•   2.4 东北虎源细小病毒分离株的生物信息学分析
•     2.4.1 主要ORF序列的分析
•     2.4.2 NS1基因序列校对后ORF预测
•     2.4.3 NS1蛋白的氨基酸序列分析
•     2.4.4 NS1蛋白磷酸化位点预测分析
•   2.5 东北虎源细小病毒NS1蛋白的原核表达和纯化
•     2.5.1 NS1基因的引物设计及合成
•     2.5.2 PCR扩增基因及琼脂糖凝胶电泳
•     2.5.3 重组表达载体的构建及鉴定
•     2.5.4 NS1蛋白的原核表达与纯化
•   2.6 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备
•     2.6.1 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备
•     2.6.2 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体效价的测定
•     2.6.3 NS1表达产物的Western-Blotting分析
•   2.7 东北虎源细小病毒NS1蛋白间接ELISA方法的建立
•     2.7.1 方阵滴定法确定NS1蛋白最佳包被浓度及血清最佳稀释度
•     2.7.2 最佳封闭液
•     2.7.3 酶标二抗最佳工作浓度
•     2.7.4 酶标二抗最佳作用时间
•     2.7.5 底物最佳作用时间
•     2.7.6 ELISA阴阳性临界点的确定和结果判断方法
•     2.7.7 特异性、敏感性试验
•     2.7.8 重复性试验
•     2.7.9 间接ELISA方法对临床种猫科动物抗体的检测
•   2.8 东北虎源细小病毒诱导F81细胞凋亡
•     2.8.1 FPV感染F81细胞
•     2.8.2 Tunel细胞凋亡检测
•     2.8.3 DNA片段化分析
•     2.8.4 荧光定量的方法检测凋亡相关因子的变化
•     2.8.5 Western方法检测凋亡相关因子的变化
•     2.8.6 统计学分析
• 3 实验结果
•   3.1 东北虎源细小病毒鉴定结果
•     3.1.1 粪便样品PCR检测结果
•     3.1.2 细胞传代分离病毒结果
•     3.1.3 病毒毒力的测定
•     3.1.4 病毒的电镜结果
•     3.1.5 理化性质试验结果
•     3.1.6 病毒的血凝试验结果
•     3.1.7 PCR检测及测序结果
•   3.2 动物回归试验结果
•     3.2.1 幼猫的临床症状
•     3.2.2 幼猫组织PCR检测结果
•     3.2.3 幼猫组织病理学变化
•   3.3 东北虎源细小病毒主要ORF克隆结果
•     3.3.1 分离毒株扩增主要ORF的PCR结果
•     3.3.2 分离株主要ORF序列分析
•     3.3.3 FPV-HER-NEFU分离株NS1蛋白氨基酸同源性分析
•     3.3.4 东北虎源细小病毒分离株NS1基因编码蛋白的生物信息学分析
•   3.4 东北虎源细小病毒NS1基因的克隆
•     3.4.1 东北虎源NS1基因的扩增
•   3.5 东北虎源细小病毒NS1基因的原核表达
•     3.5.1 东北虎源NS1基因原核表达载体的构建和鉴定
•     3.5.2 重组蛋白的诱导表达
•     3.5.3 重组蛋白NS1的纯化
•   3.6 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
•   3.7 重组蛋白的Western blot鉴定
•   3.8 间接ELISA方法的建立
•     3.8.1 ELISA抗原最佳包被浓度及血清稀释度的筛选
•     3.8.2 最佳封闭液的确定
•     3.8.3 酶标二抗的最佳工作浓度的确定
•     3.8.4 酶标二抗最佳工作时间的确定
•     3.8.5 底物最佳作用时间的确定
•     3.8.6 ELISA阴阳性临界点的确定及结果判断方法
•     3.8.7 ELISA方法的特异性分析
•     3.8.8 ELISA方法的敏感性分析
•     3.8.9 重复性分析
•     3.8.10 间接ELISA方法对临床种猫科动物抗体的检测
•   3.9 东北虎源细小病毒诱导F81细胞凋亡
•     3.9.1 Tunel细胞凋亡检测
•     3.9.2 DNA片段化分析
•     3.9.3 FPV感染对F81细胞凋亡的影响
•     3.9.4 FPV感染对F81细胞内Caspase及Fas表达的影响
•     3.9.5 FPV感染F81细胞对线粒体通路相关基因表达水平的影响
• 4 讨论
•   4.1 东北虎源细胞病毒的分离和鉴定
•   4.2 动物实验分析
•   4.3 东北虎源细小病毒NS1蛋白的表达
•   4.4 间接ELISA方法的初步建立
•   4.5 东北虎源FPV对F81细胞凋亡的影响
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵宏敬

导师: 邢明伟

关键词: 细小病毒,蛋白,检测方法,细胞凋亡,东北虎

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北林业大学

基金: 十三五国家重点研发计划“珍稀濒危野生动物重要疫病防控与驯养繁殖技术”(Grant No.2017YFD0501702)研发项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000110

总页数: 72

文件大小: 7455K

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