全文摘要
本发明公开了一种校正菌株E.coliWYL，为大肠杆菌EscherichiacoliWYL，保藏编号为CCTCCNO:M2017770。本发明还同时公开了利用上述校正菌株E.coliWYL进行的校正高通量测序原核与真核微生物基因序列读取数的方法。本发明通过校正菌株的构建及其在样品中的添加，实现样品中原核微生物群落16SrRNA基因与真核微生物群落18SrRNA\/ITS基因高通量测序读取数量的校正，以弥补现有技术的不足，使得样品中原核与真核微生物能更好的统筹，将有利于全面了解样品中微生物的群落结构变化。
主设计要求
1.校正菌株E.coliWYL，其特征是：为大肠杆菌EscherichiacoliWYL，保藏编号为CCTCCNO:M2017770。
设计方案
1.校正菌株E.coli WYL，其特征是：为大肠杆菌Escherichia coli WYL，保藏编号为CCTCC NO:M 2017770。
2.利用如权利要求1所述的校正菌株E.coli WYL进行的校正高通量测序原核与真核微生物基因序列读取数的方法，其特征是依次包括以下步骤：
1)、将校正菌株E.coli WYL，重悬于无菌水中，得菌悬液；
2)、校正菌株的添加：
将步骤1)所得的菌悬液加入至作为待测样品的土壤中，添加浓度为105<\/sup>-107<\/sup>cells g -1<\/sup>，冰浴环境下搅拌混匀；
3)、样本原核与真核微生物高通量测序：
提取土壤DNA，分别采用原核微生物通用引物515F\/806R和真核微生物通用引物ITS-F\/ITS-R对原核微生物16S rRNA基因与真核微生物ITS基因进行高通量测序，从而获得原核与真核微生物群落结构分类组成信息及其测序读取数量；
515F 5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’
806R 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’
ITS-F 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
ITS-R 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’
4)、测序数据过滤与注释：
将步骤3)所得的高通量测序数据采用QIIME软件进行质控与过滤；正向与反向测序结果采用FLASH软件进行拼接；采用UPARSE软件将优质序列按97％的相似度归为一个OTU；将校正菌株中人工设计515F\/806R及ITS-F\/R所对应碱基信息分别添加进SILVA数据库及Unite数据库，采用包含校正菌株碱基信息的SILVA数据库及Unite数据库分别对原核微生物及真核微生物OTU进行注释；
5)、校正计算：
通过对单个样品中原核微生物16S rRNA基因及真核微生物ITS基因的高通量测序，获得各分类水平及各分类单元的原核微生物群落测得序列数量组成(Taxon Pj<\/sub>，j＝1,2,3,……,n)及真核微生物群落测得序列数量组成(TaxonEj<\/sub>，j＝1,2,3,……,n)，且原核与真核微生物群落中均包含校正菌株的测得序列数量(ASP<\/sub>和ASE<\/sub>)；通过校正菌株在原核与真核微生物群落中的16S rRNA基因与ITS基因读取数量的比值获得校正系数 技术领域 本发明属于微生物领域，涉及一株细菌菌株染色体基因的改造，并基于该人工改造细菌菌株，提供了一种实现原核微生物与真核微生物的高通量测序结果中基因序列读取数量(Number of reads)校正的技术。 背景技术 微生物因其特有的物种丰富度，基因、代谢、生存环境多样性，以及大型动植物无法比拟的快速繁殖、变异速度，具有巨大的挖掘潜能和较高的经济价值。借助高通量测序技术，我们对微生物群落结构的认知正在被逐步推进，而全面解析微生物群落结构与其生存环境间相互作用关系，将成为进一步利用微生物解决农业、医疗、化工、环境等领域中科学问题的关键。 目前，高通量测序解析微生物群落结构的原理是基于微生物16S rRNA基因与18SrRNA\/ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)基因的差异，分别采用不同的引物对原核微生物群落16S rRNA基因或真核微生物群落18S rRNA\/ITS基因进行扩增和分析，独立表征原核微生物与真核微生物的群落结构组成。即，需由两次分别针对原核微生物群落和真核微生物群落结构的高通量测序结果，才可表征某一样品中整个微生物群落结构的变化。通常，高通量测序技术的测序深度为30,000至50,000读取数量(reads)，在此测序深度下可较好的平衡测序成本及数据可靠性代表性间的关系。然而，当同一样本中原核与真核微生物的总量存在数量级差异时，分别针对16S rRNA基因与18S rRNA\/ITS基因的测序会使得原核微生物总量与真核微生物总量被同时固定为等同的测序深度，从而导致两者间本身的差异被缩小了。例如，土壤样本中存在1.0×10 9<\/sup>copies g -1<\/sup>的原核微生物，其中变形菌门细菌的数量为3.5×108<\/sup>copies g -1<\/sup>，占据原核微生物总量的35％；与此同时，同一土壤样本中，共有1.0×108<\/sup>copies g -1<\/sup>的真核微生物，包含子囊菌门的数量为8.0×107<\/sup>copies g -1<\/sup>，占据真核微生物总量的80％；当分别对土壤原核和真核微生物进行深度为50,000reads的高通量测序时，即原核和真核微生物的高通量测序样本量均为50,000reads，则理论测得变形菌门(原核微生物)数量为17,500reads，子囊菌门(真核微生物)数量则为40,000reads。当两者进行相互比较时，因为分别的两次测序使得原核微生物总量与真核微生物总量被固定为相同大小的样本，使得本身变形菌门(3.5×108<\/sup>copies g -1<\/sup>，17,500reads)与子囊菌门(8.0×107<\/sup>copies g -1<\/sup>，40,000reads)间的数量差异被模糊，从而可能得出土壤中子囊菌门真菌数量更多的错误结论。 一个样本中，微生物的分类组成成百上千，上述相同测序深度导致的变形菌门与子囊菌门的比较误差只是其中很小一部分。为比较同一样品中，原核微生物与真核微生物间的变化差异，急需一种校正两次高通量测序基因读取数量(Number of reads)的方法，弥补现有分析方法的缺陷，使得原核微生物与真核微生物间变化的比较更为准确，且两者间数据可更好的进行统一，为全面解析样本微生物群落变化及微生物生态研究具有重要意义。 发明内容 本发明要解决的技术问题是：通过校正菌株的构建及其在样品中的添加，实现样品中原核微生物群落16S rRNA基因与真核微生物群落18S rRNA\/ITS基因高通量测序读取数量的校正，以弥补现有技术的不足，使得样品中原核与真核微生物能更好的统筹，将有利于全面了解样品中微生物的群落结构变化。 为解决上述技术问题，本发明提供一种校正菌株E.coli WYL，为大肠杆菌Escherichia coli WYL，保藏编号为CCTCC NO:M 2017770。 本发明还同时提供了利用上述校正菌株E.coli WYL进行的校正高通量测序原核与真核微生物基因序列读取数的方法，依次包括以下步骤： 1)、将校正菌株E.coli WYL，重悬于无菌水中，得菌悬液； 2)、校正菌株的添加： 将步骤1)所得的菌悬液加入至作为待测样品的土壤中，添加浓度为105<\/sup>-107<\/sup>cellsg-1<\/sup>，冰浴环境下搅拌混匀(搅拌时间约为5min)； 3)、样本原核与真核微生物高通量测序： 提取土壤DNA(提取方法参照MoBio 申请码:申请号:CN201910065304.9 申请日:2019-01-23 公开号:CN109652337A 公开日:2019-04-19 国家:CN 国家/省市:86(杭州) 授权编号:CN109652337B 授权时间:20191112 主分类号:C12N 1/20 专利分类号:C12N1/20;C12Q1/6869;G16B30/00;G16B20/00;G16B50/00;C12R1/19 范畴分类:18H; 申请人:浙江大学 第一申请人:浙江大学 申请人地址:310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号 发明人:汪海珍;杨黎;楼骏;严康;王昌毅;徐建明 第一发明人:汪海珍 当前权利人:浙江大学 代理人:金祺 代理机构:33212 代理机构编号:杭州中成专利事务所有限公司 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计设计说明书
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