CDR1as对人脐带间质干细胞增殖和分化的作用研究

论文摘要

目的:人脐带间质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs）被广泛用于组织的损伤修复,了解调控hucMSCs的增殖分化作用助于提高hucMSCs的应用效果。环状RNA（circRNA）是一类新发现的非编码RNA,研究显示其存在于真核细胞中并参与细胞的增殖、凋亡、衰老等多个生物学过程。本文旨在探究hucMSCs中表达的circRNAs,并研究hucMSCs中高表达的CDR1as对其增殖分化的调控作用。方法:检索circBase数据库,从中挑选出5个表达于间质干细胞（MSCs）中的circRNAs。采用qRT-PCR检测这些circRNAs在hucMSCs中的相对表达情况,确认其中在hucMSCs中表达量最丰富的circRNA。采用成脂诱导液诱导hucMSCs分化,并收集不同诱导时间点的RNA,使用qRT-PCR检测干性指标、脂联素、CDR1as及其它circRNAs的表达情况。利用小分子药物3,3’-二吲哚甲烷（3,3’-diindolylmethane,DIM）处理hucMSCs并检测干性指标及CDR1as的表达变化。设计针对CDR1as环状拼接位点的siRNA片段,qRT-PCR检测CDR1as的敲减效率;细胞周期、平板克隆及CCK-8实验检测CDR1as对hucMSCs增殖的影响,Western Blot分析PCNA蛋白水平的变化;流式及凋亡相关蛋白检测CDR1as对细胞凋亡的影响;qRT-PCR和Western Blot检测CDR1as敲减后,干性转录因子（stemness transcription factors,STFs）如Oct4、Sox2、Nanog等变化;成脂及成骨诱导实验检测hucMSCs敲减CDR1as后,其分化潜能的变化。结果:通过检测不同细胞株的circRNAs的表达量,发现5个circRNAs均在hucMSCs中表达,其中CDR1as在hucMSCs中相对表达量最高。HucMSCs进行成脂诱导后,随着成脂诱导时间延长,脂联素表达水平逐渐增加,而STFs如Oct4、Nanog、Sox2等表达量逐渐减少;CDR1as在hucMSCs成脂诱导后表达下调并随着诱导分化时间延长,表达量逐渐降低。DIM处理hucMSCs后,Oct4、Nanog、Sox2和Sall4干性指标及CDR1as表达明显上调。针对于CDR1as设计的siRNA在hucMSCs和293T细胞中能够显著抑制CDR1as的表达。CDR1as敲减后,平板克隆显示hucMSCs形成的克隆数显著减少,CCK-8实验显示hucMSCs的增殖速率减慢,细胞周期分析显示G0/1期细胞比例增加,而S期和G2/M期的细胞比例减少,Western Blot结果显示PCNA的表达量显著减少。流式检测细胞凋亡显示hucMSCs敲减CDR1as后,凋亡细胞比例增加;Western Blot检测凋亡相关蛋白显示Bcl-2表达减少,而Bax、actived caspase3及caspase9表达增加。Western Blot和qRT-PCR结果显示CDR1as敲减后,Oct4、Nanog、Sox2和Lin28表达下调,而Sall4未发生明显变化。成脂和成骨诱导实验显示,CDR1as敲减后,hucMSCs形成的脂肪细胞和骨细胞明显减少,qRT-PCR结果显示成骨指标骨钙素（osteocalcin,OCN）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达量明显减少。结论:CDR1as在hucMSCs中高表达。敲减CDR1as基因诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡和抑制hucMSCs分化。我们的研究为改造MSCs用于损伤修复提供了新的思路和线索。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略词中英文注释表
• 第一章 绪论
•   1.1 间质干细胞
•     1.1.1 间质干细胞的概述
•     1.1.2 非编码RNA与 MSCs的生物学特性
•     1.1.3 非编码RNA与 MSCs的应用
•   1.2 环状RNA
•     1.2.1 环状RNA的概述
•     1.2.2 环状RNA的合成以及调控
•     1.2.3 环状RNA的特征
•     1.2.4 环状RNA的功能
•     1.2.5 环状RNA与干细胞
•   1.3 CDR1as
•   1.4 小结
• 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义
•   2.1 研究目的
•   2.2 研究方法
•   2.3 实验方案设计
•   2.4 研究意义
• 第三章 circRNAs在 hucMSCs中的表达特性研究
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 细胞株
•     3.1.2 主要仪器
•     3.1.3 主要耗材及试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 检索数据库中MSCs表达的circRNAs分子
•     3.2.2 细胞培养
•     3.2.3 细胞总RNA的提取,浓度测定及逆转录
•     3.2.4 实时荧光定量PCR检测
•     3.2.5 成脂诱导实验
•     3.2.6 DIM处理hucMSCs
•     3.2.7 统计分析
•   3.3 结果
•     3.3.1 CircRNAs在不同细胞中的差异表达
•     3.3.2 CDR1as随着hucMSCs成脂分化表达下调
•     3.3.3 DIM处理hucMSCs,CDR1as表达上调
•   3.4 讨论
• 第四章 CDR1as对 hucMSCs增殖、凋亡和分化的影响
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 细胞株
•     4.1.2 主要仪器
•     4.1.3 主要耗材及试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 细胞培养
•     4.2.2 转染siRNA
•     4.2.3 平板克隆
•     4.2.4 CCK-8 细胞生长曲线
•     4.2.5 细胞周期分析
•     4.2.6 细胞凋亡检测
•     4.2.7 细胞总蛋白的提取及浓度测定
•     4.2.8 Western Blot蛋白印记
•     4.2.9 成骨诱导实验
•     4.2.10 成脂诱导实验
•     4.2.11 统计分析
•   4.3 结果
•     4.3.1 siRNA干扰CDR1as效率鉴定
•     4.3.2 敲减CDR1as抑制hucMSCs的增殖
•     4.3.3 敲减CDR1as促进细胞的凋亡
•     4.3.4 敲减CDR1as后下调hucMSCs干性,抑制hucMSCs分化
•   4.4 讨论
• 第五章 结论和展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间取得的科研成果
•   1.发表论文情况
•   2.参与发明专利情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨伦宇

导师: 许文荣

关键词: 间质干细胞,增殖,分化

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 江苏大学

基金: 国家自然科学基金(81871496),江苏省重点研发计划(社会发展)(BE2016717),镇江市重点研发计划(社会发展)(SH2018029),镇江市外泌体基础与转化应用技术研究重点实验(SS2018003)

分类号: R329.2

总页数: 74

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