赤拟谷盗Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶调控Hsp70基因表达及其抑制剂杀虫活性研究

论文摘要

近年来,在调控基因表达过程中起关键作用的组蛋白修饰越来越受到关注。组蛋白乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,由组蛋白乙酰基转移酶（Histone acetyltransferases,HATs）和组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylases,HDACs）共同调节。HATs通过在组蛋白赖氨酸残基上添加乙酰基,导致染色质结构的松弛并激活基因转录。相反,HDACs从乙酰化的组蛋白中除去乙酰基并抑制基因转录。组蛋白去乙酰化酶在昆虫的生长发育和胁迫响应中扮演重要角色,可作为潜在杀虫剂的作用靶标。目前对昆虫HDACs的研究主要局限于模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster。本文克隆了赤拟谷盗Tribolium castaneum Ⅰ类HDACs（TcHDAC1,TcHDAC3和TcHDAC8）和两种热激蛋白Hsp70（TcHsp70和TcHsc70）全长cDNA,利用RNA干扰技术系统研究了TcHDAC1,TcHDAC3和TcHDAC8在赤拟谷盗生长发育中的功能及其在调控TcHHsp70和TcHHsc70基因表达过程中的作用,并在此基础上分析了 Ⅰ类HDAC抑制剂对赤拟谷盗的杀虫活性。研究结果对于进一步揭示昆虫HDACs参与基因转录调控的分子机制和开发以HDACs为作用靶标的新型杀虫剂具有重要的科学意义和应用价值。利用RT-PCR和RACE技术获得了赤拟谷盗TcHDAC1,TcHDAC3和TcHDAC8基因的全长cDNA序列。TcHDAC1开放阅读框长1473 bp,编码490个氨基酸残基;TcHDAC3开放阅读框长1296 bp,编码431个氨基酸残基;TcHDAC8cDNA开放阅读框长1131bp,编码376个氨基酸残基。多重序列比对分析发现,TcHDAC1与阔角谷盗Gnatocerus cornutus中的GcHDAC1和黑腹果蝇中的DmRpd3分别具有96.73%和81.26%的氨基酸序列一致性;TcHDAC3与阔角谷盗GcHDAC3和黑腹果蝇DmHDAC3的氨基酸序列一致性分别为98.14%和78.77%;TcHDAC8与人hHDAC8具有40.25%的氨基酸序列一致性。时空表达模式分析发现,TcHDAC1和TcHDAC8均在3日龄卵中表达水平最高,TcHDAC3在1日龄蛹中表达水平最高,Ⅰ类HDACs表达量均在预蛹到1日龄蛹显著上升;TcH和TcHDAC3在胸部表达水平最高,TcHDAC8在脂肪体表达水平最高。这些结果表明I类HDACs可能在赤拟谷盗生长发育过程中具有重要作用。分别高温（45℃）、低温（4℃）和百草枯处理赤拟谷盗2日龄雌虫,发现TcHDAC1,TcHDAC3和TcHDAC8的表达水平分别在高温处理2h,4 h和2h后显著下调了 58%,67%和79%。TcHDAC1在低温处理2 h,4 h和12 h后的表达水平显著高于对照组,分别增加3.05倍,3.13倍和3.37倍。与对照组相比,TcHDAC3的表达水平在低温处理4 h后上升1.64倍,TcHDAC8在低温处理1h和2h后下调表达,但4h后上调表达。在百草枯处理1 h后,TcHDAC1和TcHDAC3的mRNA表达水平分别增加2.44倍和4.35倍,百草枯处理也导致TcHDAC8的表达水平增加。这些结果表明赤拟谷盗I类HDACs可能参与非生物胁迫信号通路。利用RT-PCR和RACE技术克隆了赤拟谷盗TcHHsp70和TcHsc70基因全长cDNA序列。TcHHsp70cDNA开放阅读框长1941 bp,编码646个氨基酸残基;TcHsc70 cDNA开放阅读框长1893 bp,编码630个氨基酸残基。多重序列比对分析发现,TcHHsp70与其它昆虫同源Hsp70具有较高的氨基酸序列一致性,包括斜纹夜蛾Spodoptera litra（82.04%）,甘蓝夜蛾Mametra brassicae（80.80%-）,黑腹果蝇（79.13%）;TcHsc70与其它昆虫同源Hsc70具有71.76-72.48%的氨基酸序列一致性;TcHsp70和TcHsc70之间的氨基酸序列一致性为80.96%。基因组结构分析发现,TcHHsp70没有内含子,而TcHsc70含有2个内含子。TcHsp70表达水平在高温（45℃）处理1h和12 h后分别增加1081倍和1318倍,但与对照组相比,TcHsc70的表达水平在高温处理后无显著差异。这些结果表明TcHsp70在在赤拟谷盗热激响应过程中具有重要作用。利用RNA干扰技术研究了TcHDAC1,TcHDAC3和TcHDAC8,和在赤拟谷盗生长发育中的功能及其在调控TcHsp70和TcHsc70基因表达过程中的作用。幼虫期RNA干扰发现,TcHDAC1干扰组幼虫只有12%成功化蛹,并且在蛹期全部死亡;TcHDAC3干扰组幼虫只有17%成功化蛹,并且在蛹期出现翅的畸形,成功化蛹的虫体只有39%的蛹能羽化,并且所有羽化成虫都出现翅的畸形;TcHDAC8干扰组幼虫有98.67%都能成功化蛹并正常羽化。注射dsTcHDACs后第6天利用定量PCR检测了TcHHsp70和TcHsc70的表达变化。与对照组相比,TcHDAC1干扰组TcHsp70的表达水平降低了67%,TcHHsc70的表达水平增加4.22倍;TcHDAC3干扰组TcHsp70的表达水平降低了62%,但TcHsc70的表达水平没有显著变化;TcHDAC8干扰组TcHsp70和TcHsc70的表达水平分别增加2.16倍和2.91倍。蛹期RNA干扰结合4日龄雌性成虫高温处理发现,与对照组相比,TcHDAC1干扰组TcHHsc70的表达水平在高温处理2h、4 h和12 h后分别显著上升了4.08倍、7.21倍和37.18倍;TcHHDAC8干扰组TcHsp70的表达水平在高温处理1 h和2h后分别上升了2.29倍和3.47倍;TcHDAC3干扰组TcHsp70的表达水平在高温处理1h、2h和12h后分别降低了38%,58%和64%。此外,虽然dsTcHDAC1处理抑制TcHsp70的基础表达,但在45℃热激处理后,dsTcHDACI处理组TcHHsp70的表达水平与对照组相似。这些结果进一步说明I类HDACs在赤拟谷盗生长发育中起到至关重要的作用,并且可调控Hsp70的表达。利用定量PCR分析了曲古抑菌素（TSA）和伏立诺他（SAHA）对赤拟谷盗HDACs表达水平的影响并测定了这2种HDAC抑制剂对赤拟谷盗的杀虫活性。与对照组相比,SAHA 处理1天后TcHDAC1、TcHDAC3、TcHDAC6、TcHDAC7和TcHDC8的 mRNA 表达水平分别下降 70%,75%,65%,80%和 70%;SAHA 处理 3 天后TcHDAC1、TcHDAC3、TcHDAC6、TcHDAC7 和 TcHDAC8 的 mRNA 表达水平分别下降 60%,74%,40%,73%和33%;SAHA处理6天后TcHDAC7的mRNA表达水平下降58%,其它HDACs的mRNA表达水平无显著变化。TSA处理1天后TcHDAC1、TcHDAC3、TcHDAC6、TcHDAC7和TcHDAC8的mRNA表达水平分别下降80%,53%,51%,49%和49%;TSA处理3天后TcHDAC1、TcHDAC3、TcHDAC6、TcHDAC7 和TcHDAC8 mRNA 表达水平分别下降 29%,38%,70%,48%和55%;TSA处理6天后TcHDAC7的mRNA表达水平下降53%,其它HDACs的mRNA表达水平无显著变化。SAHA和TSA处理对TcHDAC11的mRNA表达水平没有抑制作用。1 mg/mL浓度TSA和SAHA处理幼虫在第二天全部死亡,而溴氰菊酯处理幼虫在第四天全部死亡;100 μg/mL浓度下SAHA和溴氰菊酯处理的幼虫最终存活率分别为33%和37%,差异不显著,而TSA处理的幼虫最低只有17%。10μg/mL浓度下SAHA和溴氰菊酯处理的幼虫最终存活率均为50%,而TSA处理的幼虫最终存活率最低只有20%,说明TSA的杀虫效果更为明显。这些结果表明HDACs抑制剂对赤拟谷盗具有较好的杀虫活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
•   1 HDACs分类
•   2 HDACs与疾病
•     2.1 HDACs与炎症
•     2.2 HDACs与癌症
•     2.3 HDACs与神经系统疾病
•     2.4 HDACs与心血管疾病
•   3 HDACs在植物上的相关研究
•     3.1 调控植物发育和代谢
•     3.2 参与应激胁迫与免疫
•   4 昆虫组蛋白去乙酰化酶（HDACs）
•     4.1 HDACs与昆虫生长发育
•     4.2 HDACs与昆虫衰老和寿命
•     4.3 HDACs与昆虫免疫
•     4.4 HDACs与昆虫逆境胁迫反应
•   5 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）
•     5.1 HDAC抑制剂的种类
•     5.2 HDAC抑制剂在疾病治疗方面的相关研究
•     5.3 植物HDAC抑制剂的相关研究
•     5.4 昆虫HDAC抑制剂的相关研究
•   6 研究目的与意义
• 第二章 赤拟谷盗I类组蛋白去乙酰化酶基因的克隆与mRNA表达分析
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 供试虫源
•     2.2 主要试剂
•     2.3 主要仪器
•     2.4 总RNA提取
•     2.5 cDNA模版的合成
•     2.6 引物设计与合成
•     2.7 PCR扩增
•     2.8 cDNA末端快速扩增（RACE）
•     2.9 PCR产物回收
•     2.10 连接转化
•     2.11 菌落PCR
•     2.12 应激胁迫处理
•     2.13 荧光定量PCR
•     2.14 序列分析
•     2.15 数据处理
•   3 结果与分析
•     3.1 赤拟谷盗I类HDACs基因的克隆与序列分析
•     3.2 赤拟谷盗I类HDACs时空表达
•       3.2.1 赤拟谷盗I类HDACs不同发育阶段表达模式
•       3.2.2 赤拟谷盗I类HDACs不同组织表达模式
•     3.3 赤拟谷盗I类HDACs的胁迫诱导表达
•   4 讨论
• 第三章 赤拟谷盗两种热激蛋白70基因的克隆和mRNA表达分析
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 供试虫源
•     2.2 主要试剂
•     2.3 主要仪器
•     2.4 总RNA提取
•     2.5 cDNA模版的合成
•     2.6 引物设计与合成
•     2.7 PCR扩增
•     2.8 cDNA末端快速扩增（RACE）
•     2.9 PCR产物回收
•     2.10 连接转化
•     2.11 菌落PCR
•     2.12 应激胁迫处理
•     2.13 荧光定量PCR
•     2.14 序列分析
•     2.15 数据处理
•   3 结果与分析
•     3.1 赤拟谷盗TcHsp70和TcHsc70基因的克隆与序列分析
•     3.2 TcHsp70和TcHsc70的基因组结构
•     3.3 TcHsp70和TcHsc70对热激和冷激胁迫的响应
•   4 讨论
• 第四章 赤拟谷盗Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶对Hsp70基因的表达调控
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 供试虫源
•     2.2 主要试剂
•     2.3 主要仪器
•     2.4 dsRNA合成
•     2.5 PCR扩增
•     2.6 PCR产物回收
•     2.7 转录
•     2.8 dsRNA纯化
•     2.9 dsRNA注射
•     2.10 应激胁迫处理
•     2.11 总RNA提取
•     2.12 荧光定量PCR
•     2.13 数据处理
•   3 结果与分析
•     3.1 幼虫RNA干扰效率分析
•     3.2 幼虫RNA干扰表型分析
•     3.3 蛹期RNA干扰效率分析
•     3.4 RNA干扰赤拟谷盗I类HDACs基因对TcHsp70和TcHsc70表达的影响
•   4 讨论
• 第五章 赤拟谷盗组蛋白去乙酰化酶抑制剂杀虫活性分析
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 供试虫源
•     2.2 主要试剂
•     2.3 主要仪器
•     2.4 药剂处理
•     2.5 总RNA提取
•     2.6 引物设计与合成
•     2.7 荧光定量PCR
•     2.8 数据处理
•   3 结果与分析
•     3.1 SAHA对HDACs的抑制效果
•     3.2 TSA对HDACs的抑制效果
•     3.3 杀虫活性分析
•   4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈民轩

导师: 王建军,徐健

关键词: 组蛋白去乙酰化酶,抑制剂,干扰,赤拟谷盗,热激蛋白

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

基金: 国家自然科学基金资助项目“赤拟谷盗2种精氨酸激酶基因的功能与调控机制的比较分析”(31572000)

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001474

总页数: 87

文件大小: 7868K

下载量: 75